Глава 5. Диагностика панкреатитов • 255

М етод, предложенный G. W. Schwert и Y. Takenaka [369] для измерения тонкокишечного трипсина, был модифицирован G. Lundh [299]; ниже приведена именно эта модификация. Данный вариант требует приготовле­ния бензоиларгинина (БА) и N-бензоиларгининэтилового эфира (БАЭЭ), которые, если необходимо, могут быть синтезированы по методу Schwert и Eisenberg [368]. Используются растворы (0,001 М) БА и БАЭЭ на трис-бу-фере (рН 8,0) с 0,02 М СаС1₂. Спектрофотометр настраивается таким обра­зом, что он дает поглощение «ноль» при 2 мл БАЭЭ и 1 мл буфера.

Определение проводится при длине волны 253 нм и ширине щели 1,5 мм с помощью стандартного спектрофотометра и 1 см кварцевых яче­ек. Сначала определяется разница в поглощении БА и БАЭЭ (2 мл раство­ра и 1 мл буфера в каждой кювете), которая должна составлять 0,5 — 0,6 в переходном режиме. Затем заполняются две кюветы: одна — с 2 мл раство­ра БА и некоторым количеством пробного раствора для проведения анали­за, вторая с 2 мл БАЭЭ и таким же количеством пробного раствора. Объем в обеих кюветах доводится буфером до 3 мл. Для кюветы с БАЭЭ в свето­вом луче время увеличения поглощения определяется в пределах от 0,2 до 0,3 (по шкале). Если пробный раствор является светопоглощающим, то при измерении скорости гидролиза делается соответствующее допущение. Например, если разница между кюветой со стандартом БА и кюветой с пробой БА составляет 0,2 в переходном режиме, время, необходимое для увеличения поглощения в кювете с пробой БАЭЭ, определяется в пределах от 0,4 до 0,5 [5]. Температура окружающего воздуха должна быть (насколь­ко это возможно) одинаковой при всех измерениях. Если приготавливается стандартный раствор трипсина, поглощение измеряется при 280 нм и, со­ответственно, рассчитываются концентрации для построения стандартной кривой. С помощью этой кривой определяется ферментативная актив­ность, выражаемая в мкг/мл.

Альтернативным и широко используемым методом оценки трипсина в тонкокишечной жидкости является метод Н. S. Wiggins [433]. Он основы­вается на определении скорости высвобождения ионов водорода из специ­фического субстрата БАЭЭ.

БАЭЭ (0,5 г) растворяют в 100 мл 1:10 разведенного 1 % раствора бар­битурата натрия. Процедуры проводятся при 25 °С и рН 9 (если необходи­мо, рН верифицируется непосредственно перед использованием). Тонко­кишечную жидкость (1 мл) смешивают с 9 мл 0,05 М ацетатного буфера и нагревают до 25 "С. Разведенную тонкокишечную жидкость (1 мл) затем смешивают с 5 мл раствора БАЭЭ в реактивном сосуде (приблизительно 8 х 2,5 см) и помещают на магнитную мешалку; электроды рН-метра по­гружают в этот сосуд.

Начальная величина рН, составляющая около 8,5, постепенно снижает­ся. При ее снижении до 8,0 реакция останавливается и добавляется 0,1 мл 0,04 N. NaOH, что вызывает повышение рН до 8,4; это повторяется, когда рН вновь падает до 8. Определяется время, в течение которого высвобож­дается 4 мЭкв ионов водорода. Для образцов с нормальной трипсиновой активностью оно составляет менее 4 мин. Если оно превышает 10 мин, процедуру повторяют с разведением тонкокишечной жидкости 1:5. Если время вновь превысит 10 мин, результат регистрируется как значение ме­нее 2 мЭкв/мл в минуту.

Результаты подсчитываются следующим образом:

(Добавленный NaOH, мЭкв / время) х Разведение тонкокишечной жидкости = высво­божденный Н⁺, мЭкв/мин в 1 мл тонкокишечного содержимого.