Изменения клеточной мембраны в процессе развития

Экспрессия различных компонентов мембраны изменяется во времени и пространстве. Клетки разных типов характеризуются различными компонентами клеточной поверхности, к тому же последние изменяются по мере развития клеток. Эти тканеспецифические мембранные компоненты часто выявляются с помощью антисывороток, поэтому их называют антигенами дифференцировки (Boyse, Old, 1969).

Специфические антигены дифференцировки можно идентифицировать в настоящее время с помощью моноклональных антител (рис. 15.21). Эти антитела получают путем инъекции чужеродных клеток мышам (или клеток мыши одной линии мышам другой линии) Мышиные В-лимфоциты будут продуцировать антитела против любого чужеродного компонента этих клеток, причем каждый В-лимфоцит синтезирует антитела только одного типа. Эти лимфоциты были сделаны «бессмертными» путем слияния их со злокачественными В-лимфоцитами (клетками миеломы), которые мутировали таким образом, что 1) перестали синтезировать собственные антитела и 2) утратили фермент гипоксантин-фосфорибозилтрансферазу (ГФРТ), участвующий в обмене пуринов. Последнее изменение означает, что клетки миеломы способны лишь синтезировать пуриновые нуклеотиды de novo и не способны использовать пурины, содержащиеся в культуральной среде. После слияния клетки выращивают в среде с добавлением аминоптерина – вещества, ингибирующего синтез пуринов de novo. В результате неслившиеся клетки миеломы гибнут из-за пуринового голодания: они не могут получать пуриновые нуклеотиды с помощью синтеза, опосре-

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 3: Пер. С англ. – м.: Мир, 1995. – 352с.

22 ГЛАВА 16

дованного ГФРТ, а их синтез ингибирован аминоптерином. Нормальные В-лимфоциты в культуре не делятся, поэтому они также погибают. Продукт слияния В-лимфоцита и миеломной клетки - гибридома - пролиферирует, получая ГФРТ от В-лимфоцита и способность к росту от злокачественной клетки. Кроме того, каждая из этих гибридом секретирует специфические антитела В-лимфоцита. Затем среду, в которой растут гибридомы, тестируют на антитела, способные связываться с исходной популяцией клеток. Такие антитела, первичным источником которых является единственный В-лимфоцит, называются моноклональными антителами. Моноклональные антитела можно получать в неограниченных количествах и с их помощью узнавать антигены (белки, липиды или углеводы), экспрессированные в малых дозах (Kohler, Milstein, 1975).

Рис. 15.21. Протокол получения моноклональных антител. Клетки селезенки иммунизированной мыши сливаются с мутантными клетками миеломы, лишенными фермента ГФРТ. Клетки выращиваются в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ). Неслившиеся клетки миеломы в этой среде расти не могут, так как аминоптерин блокирует единственный путь, посредством которого они могут синтезировать пуриновые нуклеотиды. В-клетки при культивировании погибают, несмотря на то что содержат фермент (ГФРТ), позволяющий им использовать гипоксантин, содержащийся в среде. Растут и делятся только слившиеся клетки (гибридомы). Лунки, в которых растут гибридомы. проверяются на наличие эффективных антител: из «положительных» лунок клетки высевают при плотности, достаточно низкой для того, чтобы индивидуальные клетки могли дать отдельные клоны. Полученные клоны выделяют и снова производят скрининг на эффективные антитела. Такие антитела будут моноклональными. Гибридому, продуцирующую эти антитела, можно вырастить и заморозить. (По Yelton, Scharff, 1980.)

Моноклоналъные антитела против специфических клеточных типов позволили обнаружить многочисленные антигены дифференцировки, появляющиеся в процессе развития в разных местах и в различное время. На рис. 15.22 представлены различные молекулы клеточной поверхности в пространственно разграниченных слоях нейральной сетчатки только что вылупившегося цыпленка. Каждое из моноклональных антител узнает разные молекулы клеточной мембраны. Как видно из этой скомпонованной фотографии, мембраны всех клеток нейральной сетчатки не одинаковы. Фактически различаться могут даже разные участки мембраны одной и той же клетки: так, мембрана аксона и мембрана тела нейрона содержат разные молекулы. На рис. 15.23 показаны временные изменения клеточной мембраны одной эпителиальной клетки дрозофилы по мере того, как эта клетка превращается в фоторецептор сетчатки. Моноклинальные антитела были получены после инъекции мыши гомогената тканей головы дрозофилы, а затем набор антител был тестирован на клетках имагинального диска глаза личинки третьего возраста: этот диск дифференцируется в структуры глаза. Как только недифференцированные эпителиальные клетки диска приобретали свойства нейрона, они экспрессировали антиген 22С10. Этот антиген был обнаружен и на других типах нервных клеток. Однако вскоре клетка начинала экспрессировать другую молекулу клеточной мембраны – антиген 24В10. Эта молекула появлялась только у тех нейронов, которые давали начало фоторецепторам. На более поздних стадиях (спустя примерно 80 ч) на некоторых областях созревающих фоторецепторов появлялся антиген 21А6 и затем другой антиген, 28Н9, характерный для окончательно дифференцированных фоторецепторов сетчатки (Zipursky et al., 1984).

Таким образом, поверхностные мембраны клеток различных типов содержат разные молекулы, и эти молекулы могут меняться по мере созревания данной клетки.