Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 3: Пер. С англ. – м.: Мир, 1995. – 352с.

РОСТ И ОНКОГЕНЕЗ 219

Как клеточные онкогены вступают на неверный путь

Формирование большей части человеческих опухолей обусловлено все же не вирусами. Существуют другие механизмы, посредством которых протоонкогены приобретают способность трансформировать клетку. Эти механизмы включают мутации, амплификацию генов и перестройку хромосом.

Онкогенез путем мутаций

Еще в начале шестидесятых годов было известно, что мутагены (агенты, вызывающие мутации) в то же время служат канцерогенами (агентами, вызывающими образование злокачественных опухолей). Брюс Эймс (Ames, 1979) показал, что митогенная способность данного вещества прямо пропорциональна его способности вызывать опухоли. Каким-то образом молекулы, повреждающие ДНК (судя по их способности индуцировать мутации у бактерий), приводят к формированию опухолей у мышей.

В 1982 г. Ших и Вейнберг (Shih, Weinberg, 1982) трансфицировали клетки NIH3T3, введя в них ДНК из опухолевых клеток мочевого пузыря человека (рис. 20.33). Некоторые из мышиных фибробластов захватывают человеческую ДНК, в составе которой может оказаться человеческий ген, трансформировавший клетки мочевого пузыря. Клетки N1H3T3, содержащие этот ген, начинали быстро расти и формировать очаги трансформированных клеток, которые затем были изолированы. ДНК этих клеток была выделена, фракционирована и использована для трансфекции другой группы клеток NIH3T3. Снова некоторые из клеток получили человеческий

Рис. 20.33. Выделение мутантного гена ras из карциномы мочевого пузыря человека. Человеческая ДНК характеризуется наличием коротких повторяющихся сегментов ДНК – Alu-последовательностей, располагающихся по всему геному, ДНК из клеток карциномы мочевого пузыря человека экстрагировали, разрезали рестрикционными ферментами и вносили в культуру мышиных фибробластов. Мышиные клетки, включившие онкоген, становились злокачественными и образовывали скопления – клеточные островки. ДНК из этих островков также экстрагировали, расщепляли и вносили в другую чашку с мышиными фибробластами. Когда появились островки, ДНК из их клеток вновь разрезали рестрикционными ферментами и включали в фаговые векторы. Фаги размножались в культивируемых клетках E. coli. Когда бактериальные клетки разрушились, ДНК помещали на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с радиоактивной Alu-последовательностью ДНК. Клоны, содержащие Alu-последовательность. выявляли с помощью радиоавтография. Эта последовательность указывает на человеческое (а не мышиное) происхождение содержащей ее ДНК. Поскольку при этом велась селекция на злокачественность, можно полагать, что эти клоны сдержат и онкоген, ответственный за злокачественную трансформацию клеток. Затем было произведено секвенирование человеческой ДНК.

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 3: Пер. С англ. – м.: Мир, 1995. – 352с.

220 ГЛАВА 20

ген, а вместе с ним и трансформированный фенотип. ДНК этих клеток была клонирована, и клоны, содержащие человеческую ДНК, были выявлены путем гибридизации ДНК. Таким образом был изолирован человеческий ген, обусловливающий способность к злокачественному росту. Оказалось, что этот ген является человеческим гомологом онкогена ras вируса крысиной саркомы Гарвея и Кирстена. Более того, он отличался от нормального человеческого гена только по одному нуклеотиду (Tabin et al., 1982; Capon et al., 1983). Кодон двенадцатой аминокислоты вместо ГГГ (глицинового) становился ГТГ (валиновым). Результаты экспериментов, в которых использовались другие линии опухолевых клеток человека, показали, что замены аминокислот в положениях 12, 13, 59, 61 или 63 белка, состоящего из 189 аминокислот, могут активировать его трансформирующую способность (Der et al., 1986; Levinson et al., 1986). В сходных экспериментах (Zarbi et al., 1985) крысам с пищей вводили такие хорошо известные мутагены, как нитрозометилмочевина (которая вызывает точковые мутации с заменой гуанина на аденин). Вызванные ими опухоли изолировали, а затем из их клеток выделяли ДНК. В случае опухоли молочной железы, индуцированной нитрозометилмочевиной, в двенадцатом кодоне гена c-ras в результате мутации происходила замена Г на А. Было обнаружено, что трансформирующая способность других протоонкогенов также активируется мутациями в кодирующем белок участке этих генов ¹.

Мутации, делающие белок ras онкогенным, участвуют в ингибировании ГТФазной активности. В норме белок ras связывает ГТФ, катализируя его превращение в ГДФ, который остается с ним связанным. Эта реакция в значительной степени стимулируется образованием комплекса белка ras с белком, активирующим ГТФазу (БАГ). Этот белок (молекулярная масса его составляет 120 000 дальтон) повышает свою гидролизную активность более чем в 100 раз (Trahey, McCormick, 1987; Gibbs et al., 1988). Таким образом, в течение большей части времени с белком ras оказывается связанным не ГТФ, а ГДФ. ГДФ-связанная форма белка ras неактивна, а его ГТФ-связанная форма активирует другие белки. Все мутации гена ras, делающие его онкогенным, ингибируют ГТФазную активность БАГ. В этом случае БАГ сохраняет связь с белком ras, который благодаря своему ГТФ продолжает активно переносить митогенный сигнал к ядру (рис. 20.30; Caks et al., 1988; McCormick, 1989).