Методи дослідження патогенезу анемій

Вивчення метаболізму заліза в організмі. В організмі дорослої людини міститься близько 4 г заліза.

Велика частина заліза знаходиться в еритроцитах у формі порфіринового комплексу гемоглобіну, менша кількість утилізувалася тканинами у вигляді міоглобіну, гема і негемових ферментів (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Метаболізм заліза в організмі.

Надлишок заліза депонується в організмі в пулі зберігання (феритин, гемосидерін) і лабільному пулі (феритин сироватки). Основна маса депонуючого заліза поміщена| в мононуклеарних фагоцитах селезінки і печінки, в клітинах кісткового мозку і паренхімі печінки. Обмін заліза між тканинними депо здійснюється специфічним переносником – плазматичним білком трансферином, який є глобуліном, що синтезується в печінці. В нормі концентрація феритину в сироватці тісно корелює з його запасом в депо. Проте має значення також швидкість вивільнення феритину з тканин.

Вміст заліза в організмі багато в чому визначається рівнем його адсорбції з харчових продуктів і особливостями шлунково-кишкової секреції. Залізо, що надходить з їжею, захоплюється клітинами кишкового епітелію, переважно в дванадцятипалій і проксимальних відділах тонкої кишки. Перенесення заліза в плазму, де воно з'єднується з трансферином, відбувається за допомогою спеціального білка-носія. Основний споживач зв'язаного з трансферином заліза – це дозріваючі клітини кісткового мозку, які асимілюють залізо для синтезу гемоглобіну. Менші кількості трансферинового заліза доставляється до інших споживачів заліза в організмі. Залишок заліза, що включається у феритин, виводиться з калом при злущуванні епітелію. Вільне залізо, що утворюється в процесі руйнування гемоглобіну при фагоцитозі старих і патологічних еритроцитів, постійно реутилізується для еритропоезу, спочатку резервується в складі гемосидерину, а потім транспортується за участю трансферину до еритроїдних клітин-попередників кісткового мозку.

Таким чином, показанням для дослідження загальних запасів заліза в організмі, його кінетики є гіпохромні анемії з метою диференціальної діагностики залізодефіцитних анемій від сидеропенічних, при яких залізо, що надходить в кістковий мозок, не використовується достатньою мірою для еритропоезу. Динаміка вмісту заліза сироватки служить важливим показником ефективності лікування хворих залізодефіцитною анемією.

Вимірювати рівень заліза і феритину сироватки необхідно як для діагностики анемій, так і для визначення ступеня перевантаження організму залізом при деяких патологічних станах. Для оцінки метаболізму заліза в організмі використовуються такі показники:

– рівень заліза сироватки;

– залізозв'язуюча здатність сироватки;

– феритин сироватки;

– феритин еритроцитів.

Принцип методу визначення вмісту сироваткового заліза заснований на вивільненні заліза з білкового комплексу, осадження білка, подальшої кольорової реакції в результаті утворення комплексу заліза з реактивом, який здатний забарвлюватися під впливом заліза.

Нормальний вміст рівня заліза в сироватці крові 10,6-28,3 мкм/л для чоловіків, 6,6-26,0 мкм/л для жінок і6,1-26,8 мкм/л для дітей.

Для визначення залізозв'язувальної здібності до сироватки додають надлишок заліза, яке утворює з трансферином| комплекс червоного кольору, що виявляється за допомогою спектрофотометра. Потім додають адсорбент, що видаляє з розчину залізо, яке зв'язане з білком. Шляхом віднімання вмісту заліза сироватки обчислюють показник ненасиченої залізозв'язуючої здатності і відсоток насичення, які в нормі складають 44,57-53,7 мкм/л і 2,65-7,16 мкм/л.

Феритин сироватки – це залізовміщуючий глікопротеїн, присутній в тканинах у вигляді тканинноспецифічних ізоформ; у сироватці його вміст визначають радіоімунологічним методом. Коливання феритину складають від 30 до 300 нг/мл при середньому показнику 88 для чоловіків і 49 для жінок.

Рецептори для сироваткового трансферину визначають методом ELISA з використанням моноклональних антитіл до розчинного рецептора.

Феритин еритроцитів вимірюється в гепаринізованій крові після відокремлення еритроцитів від лейкоцитів і тромбоцитів, які також містять феритин. Після лізису еритроцитів вміст феритину визначають радіоімунологічним методом, за допомогою якого дається оцінка вмісту його за попередні 3 місяці – середній термін життя еритроцита. В нормі феритин в межах від 5 до 48 аттограмів| (1 аг = 10-18 г) на 1 еритроцит.

Показники обміну заліза мають важливе значення для диференціальної діагностики анемій (табл. 6.15). Діагностичне значення ці дослідження мають для підтвердження залізодефіцитної анемії, при якій різко знижується вміст сироваткового заліза – 5,4 мкмоль/л і нижче. Загальна залізозв'язувальна здатність сироватки або нормальна, або навіть дещо вища за норму, відсоток насичення залізом різко знижується.

При мегалобластній анемії , при більшості гемолітичних анемій, за винятком гемолітичної анемії Маркіафави-Мікелі, вміст заліза сироватки нормальний або дещо вищий за норму. Високий вміст заліза в сироватці спостерігається при сідеропенічних анеміях, таласемії і при синдромах з високим вмістом заліза (гемосидероз, гемохроматоз).

Таблиця 4.15

Диференціальна діагностика анемій за показниками обміну заліза

Показники обміну заліза	Захворювання
	Залізодеф-цитна анемія	В12-дефіцитна анемія	Ахрестічна анемія	Таласемія	Гемохроматоз	Анемія при хронічних захворюваннях
Рівень заліза сироватки	Різко знижений	Нормальний, декілька підвищений	Підвищений	Підвищений	Різко під-вищений	Трохи знижений
Залізозв'язуюча здатність сироватки	Підвищена	Нормальна, трохи знижена	Нормальна, трохи знижена	Нормальна	Трохи знижена	Трохи знижена
Відсоток насичення залізом	Знижений	Нормальний, трохи знижений	Підвищений	Нормальний	Підвищений	Знижений
Феритін сироватки	Різко знижений	Нормальний, трохи знижений	Підвищений	Нормальний	Підвищений	Підвищений
Феритин еритроцитів	Різко знижений	Нормальний, трохи знижений	Підвищений	Нормальний	Підвищений	Трохи знижений

Концентрація феритину в сироватці тісно корелює із загальним вмістом заліза в організмі, знижується при його дефіциті і зростає при надлишку. Рівень феритину підвищується також при гепатиті, при злоякісних захворюваннях шлунково-кишкового тракту, при гострому лейкозі, лімфогранулематозі. Феритин еритроцитів знижується нижче 5 мкмоль/л при залізодефіцитній анемії і значно підвищується при надлишку заліза (гемохроматозі|, гемосидерозі).

Методи оцінки інтенсивності гемолізу. Нормальний еритропоез складається з декількох етапів трансформації клітин: еритроїдна стовбурова клітина диференціюється до проеритробластів, найбільш ранніх клітин еритропоезу, що морфологічно ідентифікуються. Починаючи з цього етапу, по мірі подальшого дозрівання, в клітинах накопичується мРНК, що кодує глобін, котрий забезпечує синтез гемоглобіну і його певний вміст в зрілих еритроцитах. У фізіологічних умовах тривалість життя еритроцитів складає в середньому 120 днів. Еритропоетична функція знаходиться в тісному взаємозв'язку з процесами руйнування еритроцитів, які здійснюються внутрішньоклітинно в ретікуло-ендотеліальній системі, головним чином – в селезінці.

Невелика частина еритроцитів руйнується всередині судинного русла (внутрішньосудинний гемоліз). В процесі гемолізу гемоглобін розпадається на білкове тіло глобін і гем, що містить залізо.

В клітинах ретікуло-ендотеліальної системи з гема, що звільнився, утворюється вільний білірубін, який циркулює в крові в неміцному зв'язку з білком, нерозчинний в воді і отже не виділяється нирками. Основна частина вільного білірубіну надходить в печінку, де він звільняється від зв'язку з альбуміном і за участю ферментів печінки з'єднується з глюкуроновою| кислотою, утворюючи водорозчинну сполуку – білірубінглюкуронід або зв'язаний білірубін.

Продуктом перетворення білірубіну є уробілін, який при виведенні з жовчю в тонкій кишці представлений у вигляді трьох безбарвних сполук – α-уробіліноген, β-уробіліноген і γ-уробіліноген (стеркобіліноген).

В результаті дії ряду чинників як ендогенної, так і екзогенної природи відбувається гемоліз еритроцитів, укорочення терміну життя клітин і подальший розвиток анемії.

Гемолітична анемія розвивається тоді, коли кістковий мозок не здатний компенсувати їх руйнування посиленим еритропоезом. Існує така класифікація гемолітичних анемій (табл. 6.16).

При гемолітичних анеміях можливий внутрішньоклітинний (позасудинний) і внутрішньосудинний гемоліз. Внутрішньоклітинний гемоліз відбувається, як і в нормі, в клітинах фагоцитарної системи – кістковому мозку, печінці, селезінці. Старіючі, патологічно малозмінені еритроцити і з тепловими антигенами на поверхні захоплюються і руйнуються в селезінці – секвестраційний гемоліз. Еритроцити з вираженою патологією, а також що адсорбували холодові антитіла або комплемент, руйнуються в печінці. Кістковий мозок активніший відносно еритрокаріоцитів – незрілих клітин, що містять ядро, червоного ростка. При внутрішньоклітинному гемолізі, разом з еритроцитами, руйнується гемоглобін.

Таблиця 6.16

Класифікація гемолітичних анемій

Спадкові мембранопатії: – спадковий сфероцитоз (хвороба Мінковського-Шоффара) – спадковий овалоцитоз (еліптоцитоз) ензимопатії: – дефіцит глюкозо-6-фосфатдегідрогенази гемоглобінопатії: – таласемії – серповидноклітинна анемія

Набуті ізоімунні: – гемолітична хвороба новонароджених – несумісна трансфузія аутоіммунні: – анемія з тепловими аглютинінами – анемія з холодовими аглютинінами – анемія з двофазними холодовими аглютинінами (синдром Доната-Ландштейнера) – пароксизмальна нічна гемоглобінурія (хвороба Маркіафави-Мікелі) гетероімунні: – анемії, обумовлені дією лікарських препаратів – анемії, обумовлені дією біологічних токсинів – анемії, обумовлені дією інфекційних токсинів – анемії, обумовлені дією хімічних речовин

Анемія, пов'язана з руйнуванням еритроцитів механічними факторами – протезування клапанів – стеноз аорти – злоякісна гіпертензія – маршова гемоглобінурія

Внутрішньосудинний гемоліз, обумовлений грубими пошкодженнями еритроцитів, розвивається рідко, при цьому гемоглобін опиняється в судинному руслі.

З метою виявлення гемолізу необхідна певна схема обстеження, спрямована як на констатацію факту наявності руйнування еритроцитів, так і встановлення механізму розвитку патології.

Деструкцію еритроцитів підтверджують лабораторні дослідження, які виявляють зміни білірубіну сироватки, уробіліногену сечі, стеркобіліну калу, гемоглобіну плазми, гемосидерину сечі.

Методи для з'ясування патогенезу гемолізу включають тести на осмотичну стійкість еритроцитів, кислотний гемоліз, пробу Хема, цукрову пробу Гартмана-Дженкіса, визначення активності ферментів еритроцитів, електрофорез гемоглобіну, імуногематологічні тести. Важливе значення має вивчення морфології еритроцитів. В лабораторній практиці для оцінки інтенсивності гемолізу використовуються такі показники:

– білірубін плазми;

– уробілін сечі і стеркобілін калу;

– вільний гемоглобін плазми і гемосидерін сечі.

Для оцінки інтенсивності гемолізу при внутрішньоклітинному розпаді еритроцитів визначається кінцевий продукт – вільний білірубін, рівень якого в сироватці крові хворих корелює з кількістю зруйнованих еритроцитів. Метод визначення різних форм білірубіну заснований на зміні забарвлення сироватки в результаті дії діазореактиву, при чому реакція може бути прямою – зміна кольору настає безпосередньо після додавання діазореактиву і непрямою, оскільки потрібне попереднє додавання до сироватки спирту. Непряму реакцію дає вільний білірубін, а пряму – зв'язаний (білірубінглюкоронід). Кількість непрямого білірубіну відображає інтенсивність процесів гемолізу. Рівень зв'язаного або прямого білірубіну залишається в межах норми. Отже, у хворих з внутрішньоклітинним гемолізом розвивається жовтяниця з підвищенням рівня непрямого білірубіну.

Уробілін сечі і стеркобілін| калу. Незважаючи на те, що уробілін і стеркобілін відрізняються за своїми хімічними властивостями, в лабораторній практиці використовується єдиний метод для їх визначення, який заснований на властивості уробіліну давати рожеве забарвлення з реактивом Ерліха. Оскільки при внутрішньоклітинному гемолізі циркулюючий в плазмі в збільшеній кількості непрямий білірубін пов'язаний з білком при хронічній течії рівень уробіліногену в сечі нормальний або трохи підвищений.

При гемолітичній жовтяниці збільшення стеркобіліну в калі значно перевищує збільшення екскреції уробілінових тіл з сечею, їх співвідношення зростає до 300:1-500:1 (норма від 10:1 до 20:1).

Для оцінки інтенсивності гемолізу при внутрішньосудинному розпаді еритроцитів визначається вільний гемоглобін (Hb) плазми по методиці Бінга в модифікації Дарвіза і Бялко, суть якої заснована на здатності Hb вступати в реакцію з бензидином в кислому середовищі в присутності перекису водню з утворенням зеленого забарвлення, котре переходить в синє, а потім в червонувато-фіолетове. Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості гемоглобіну.

При розпаді Hb залізо його адсорбується епітелієм ниркових канальців і входить до складу гемосидерину, який у вигляді кристалів входить до складу злущеного епітелію і може бути видно при макроскопічному дослідженні сечі. Чіткіші кристали гемосидерину, забарвлені в синій колір, визначаються в сечі після попереднього додавання до осаду свіжоприготованого розчину 1 % жовтої кров'яної солі| і 1 % розчину соляної кислоти. Гемосидерінурія є характерною ознакою внутрішньосудинного гемолізу, спостерігається при хронічних аутоіммунних анеміях (пароксизмальна нічна гемоглобінурія|).

Визначення структури і метаболізму еритроцитів. В патогенезі гемолітичних анемій певне значення мають порушення структури еритроцитів. Мембранопатії і ензимопатії еритроцитів виявляються за результатами проведення таких методик:

– проба Хема;

– цукрова проба Гартмана-Дженкіса;

– кислотостійкість еритроцитів за методом Терськова і Гітельзона;

– осмотична стійкість еритроцитів;

– визначення активності ферментів еритроцитів;

– визначення тривалості життя еритроцитів.

Проба Хема. Принцип методу заснований на визначенні стійкості еритроцитів до пониження рН в присутності комплемента свіжої сироватки. Для дослідження використовують сироватку і суспензію еритроцитів хворого і донора тієї ж групи, соляну кислоту, які змішують в різних поєднаннях.

Хід проведення проби Хема. Вміст пробірок перемішують, пробірки поміщають на годину до водяної бані при 37 °С, потім центрифугують. Для оцінки 100 % гемолізу до 4,7 мл розчину аміаку додають 0,05 мл еритроцитів хворого в 0,55 мл фізіологічного розчину.

Проводиться фотометрія з подальшим обчисленням відсотка гемолізу по формулі:

, де

₁ – оптична щільність досліджуваної проби;

₂ – оптична щільність холостої проби;

₃ – оптична щільність 100 % гемолізату.

В нормі гемолізується не більше 5 % еритроцитів, якщо гемолізується| більше 6 % – проба розцінюється як позитивна. Значний гемоліз еритроцитів – до 50-80 % спостерігається при пароксизмальній нічній гемоглобінурії|, при цьому характерний гемоліз в присутності неінактивованої сироватки.

Цукрова проба Гартмана-Дженкіса в модифікації Л.І. Ідельсона заснована на кількісній оцінці ступеня гемолізу еритроцитів в розчинах з низькою іонною силою в присутності комплементу. Хід аналізу полягає в паралельному додаванні розчину сахарози певної концентрації до суспензії еритроцитів хворого і донора, сироватки донора, інактивованої сироватки. Через 10 хвилин пробірки фотометрують на фотоколориметрі з подальшим розрахунком по формулі. В нормі в пробірці, що містить еритроцити досліджуваного, гемоліз не перевищує 2-3 %.

Цукрова проба має діагностичне значення при пароксизмальній нічній гемоглобінурії|, оскільки в пробірці, що містить еритроцити хворого, гемоліз перевищує 4 %. При цьому в контрольних пробірках (що містять еритроцити хворого і інактивовану сироватку донора; еритроцити і сироватку донора) гемоліз не повинен перевищувати 1-2 %. При інших формах гемолітичних анемій проба Гартмана-Дженкіса є негативною.

Кислотостійкість еритроцитів по методу Терськова і Гітельзона. Кислотостійкість еритроцитів залежить від структури їх оболонки, яка в нормі визначається віком клітини. Принцип методу заснований на здійсненні гемолізу еритроцитів хворого шляхом дії розчину соляної кислоти в спеціальній кюветі, в якій проводиться оцінка падіння оптичної щільності суспензії в кожну одиницю часу за допомогою фотоколориметра. Розподіл еритроцитів по стійкості до часу дії кислоти зображується графічно у вигляді кислотної еритрограми, яка в нормі має певну форму і виявляється початком гемолізу на 3-й хвилині дії кислоти, максимумом розпаду еритроцитів (16 %) на 4,5 хвилині, з тривалістю гемолізу 8-10 хвилин.

При гемолітичній анемії змінюється якісний склад еритроцитів, у відповідь на гемоліз компенсаторний з'являється гіперретікулоцитоз, що призводить до зсуву кислотної еритрограми в бік стійких клітин – до 6-й, 7-й або 8-й хвилині гемолізу. Загальний час гемолізу залишається нормальним. При вродженій мікросфероцитарній гемолітичній анемії графік набуває специфічної форми – максимум еритрограми знаходиться на рівні 7-10 хвилин гемолізу, має вдвічі| менше нормальної висоту, загальний час гемолізу подовжений до 12-15 хвилин.

Міцність еритроцитів (осмотична стійкість) визначається у всіх випадках внутрішньоклітинного гемолізу. Для дослідження використовують 12 маленьких пробірок, заповнених розчином NaCl в наростаючих концентраціях від 0,28 до 0,5. В кожну з пробірок додають по краплі крові хворого, в паралельний набір пробірок – по краплі нормальної крові для контролю. Відзначають пробірки, в яких гемоліз почався і першу пробірку, де він завершився повністю. В нормі початкова концентрація гемолізу еритроцитів складає 0,44 % і нижче, завершується гемоліз при 0,32 %. При мікросфероцитарній гемолітичній анемії гемоліз починається при вищій концентрації, що свідчить про знижену осмотичну стійкість еритроцитів. У хворих таласемією при переважанні патологічно тонких клітин спостерігається підвищення осмотичної резистентності, гемоліз починається при нижчих концентраціях і в деяких випадках залишається неповним.

Визначення активності ферментів еритроцитів, що беруть участь в обміні вуглеводів, обґрунтовано тим, що при спадкових порушеннях в пентозному циклі в результаті дефіциту ферментів, що забезпечують гліколіз піруваткінази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, зменшуються запаси енергії, порушується електролітний баланс, настає гемоліз. Аномалії ферментів обумовлені генетичним поліморфізмом і клінічно вони найчастіше виявляються підвищеною чутливістю до лікарських препаратів.

Визначення тривалості життя еритроцитів вперше було проведено американським імунологом У. Ешбі в 20-х роках минулого сторіччя. В основі методу лежить диференційований підрахунок еритроцитів групової приналежності крові за системою MN, введених реципієнту, що не має цих чинників, від донора, що має чинники MN. За даними У. Ешбі, середній термін перебування еритроцитів в периферичній крові виявився рівним 1165 днів. В теперішнй час для наукових і діагностичних цілей застосовується радіологічний метод дослідження, заснований на введенні внутрішньовенно еритроцитів хворого, мічених радіоактивним хромом (⁵¹Cr), який не може повторно утилізуватися в організмі. Згідно цим дослідженням виділяють помірний гемоліз – (тривалість життя еритроцитів 20-40 днів) і виражений гемоліз (тривалість життя еритроцитів 5-20 днів). Цей метод дозволяє не лише підтвердити наявність гемолізу, але і визначити місця секвестрації еритроцитів.

Визначення біосинтезу, структури і функції гемоглобіну. Біосинтез гемоглобіну здійснюється в процесі еритропоезу. В період розвитку проеритобластів посилюється транскрипція мРНК, що кодує глобуліновий ланцюг, кожна з яких ковалентно пов'язана з групою гема. Білок гемоглобіну є тетрамером, що складається з двох пар поліпептидних ланцюгів, що позначаються  і . Синтез глобінових субодиниць, тип ланцюгів і хімічна структура окремих поліпептидів визначені генетично, здійснюється під контролем відповідних генів, успадкованих від кожного батька.

Фізіологічні форми гемоглобіну: HbA (два різновиди – HbA₁ і HbA₂ ) і HbF (фетальний| гемоглобін). Кожен вид гемоглобіну характеризується своєю поліпептидною формулою. Нормальна молекула гемоглобіну дорослих HbA₁ складається з двох -ланцюгів і двох β-ланцюгів (₂β₂) HbА₂ складається з -ланцюгів і двох -ланцюгів (₂₂). Фетальний гемоглобін HbF включає дві α-цепи і дві γ-цепи (_2γ2). В плода переважає форма гемоглобіну F, протягом останніх трьох місяців внутрішньоутробного життя синтез -ланцюгів глобіну в плода змінюється синтезом β-ланцюгів. До моменту народження дитини HbF складає 50-80 %. До 4 місяців у дитини залишаються лише його сліди, до 2,5 років фізіологічною нормою вважається менше 5 %. В еритроцитах здорової дорослої людини міститься 97 % HbA₁, 2,5 % HbA₂, менше 1 % HbF.

При патологічних станах можливий синтез молекул гемоглобіну з аномальними фізичними і хімічними властивостями, що призводять до розвитку анемій, більш тяжких у гомозигот| і більш легких у гетерозігот. Можливий гетерозиготний стан по двох різних типах аномалій.

Для визначення гемоглобінопатій застосовуються такі дослідження:

– клінічний аналіз крові: морфологія еритроцитів;

– електрофорез гемоглобіну;

– кількісне визначення HbF;

– визначення телець Гейнца;

– рентгеноструктурний аналіз молекул гемоглобіну.

Морфологічні прояви аномалій гемоглобіну маніфестують зміни форми еритроцитів: мишенєподібні при таласемії, подовжені – при серповидноклітинній анемії.

Електрофоретичне розділення гемоглобіну засноване на різниці електричних зарядів молекул гемоглобіну. Аномальний гемоглобін, що розрізняється по електрофоретичній рухливості, позначається літерами латинського алфавіту. В 1949 році професор Каліфорнійського технологічного інституту Лайнус Полінг встановив, що у хворих серповидноклітинною анемією замість звичайного гемоглобіну А в еритроцитах присутній інший вид гемоглобіну, який був позначений як HbS. Надалі виявленому аномальному гемоглобіну позначення привласнювалися в алфавітному порядку: HbC, D, E, G, H та інші, а також по географічному місцю їх опису. В лабораторній практиці на першому місці вказують гемоглобін, що виявляється при електрофорезі в найбільшій кількості.

Аномальний гемоглобін призводить до ряду патологічних змін.

Гемоглобінопатії SS (HbS 80-95 %, HbF 5-20 %) – тяжка серповидноклітинна анемія з вираженим гемолітичним синдромом.

Гемоглобінопатії SА (HbS 20-45 %, HbА 40- 70 %) – легка анемія, незначна спленомегалія, в крові поодинокі серповидноклітинні еритроцити.

Гемоглобінопатії SD (HbS 80 %, HbD 40 %) – помірна гемолітична анемія.

Гемоглобінопатії СС (HbС до 90 %) – пізня доброякісна гемолітична анемія, в крові 40-90 % мішенєподібних еритроцитів.

Гемоглобін Е стоїть на третьому місці по частоті серед найбільш поширених в світі типів гемоглобіну (після HbA і S). Найчастіше він зустрічається в Південно-Східній Азії (більше 15 %) і представників чорної раси.

Гемоглобінопатії ЕЕ (HbЕ 50-80 %, HbА 10-20 %) – гемолітична анемія, спленомегалія, в крові – мішенєподібні| еритроцити, сфероцитоз| до 80 %.

Гемоглобінопатії ЕА (HbЕ 20-40 %, HbА 50-70 %) – проявів немає, периферична кров залишається нормальною при гетерозиготності. При гомозиготності по HbE визначається помірна гіпохромно-мікроцитарна анемія із значною кількістю мішенєподібних клітин.

Кількісне визначення HbF методом однохвилинної лужної денатурації за Singer, заснованим на тому, що він в 155 разів стійкіший до лугів, чим HbA. Принцип методу полягає в тому, що при додаванні в 10 % розчин гемоглобіну 1:12 N розчину лугу денатурується в перебігу хвилини весь HbA; після видалення HbA за допомогою сірчанокислого амонію з соляною кислотою, що залишився, HbF визначають за допомогою фото колориметричного методу.

Збільшення HbF спостерігається при деяких інфекційних захворюваннях (коклюш), гострому і хронічному лейкозі, мієломній хворобі, мікросфероцитарній анемії. Найбільш значне збільшення цього показника спостерігається при хворобі Кулі (Thallassemia major), він досягає 30-60 %, в деяких випадках 80-90 %. Невелике збільшення HbF (до 10 %) спостерігається при малій таласемії.

Збільшення тілець Гейнца, які є включеннями преципітованого гемоглобіну в еритроцитах, визначаються у хворих, які є носіями аномального гемоглобіну, що одержав назву нестабільних в зв'язку із структурними змінами в певних ділянках молекули, внаслідок чого змінюється їх стабільність і розчинність, і тим самим гемоліз еритроцитів.

Морфологічно в зразках крові хворих з нестабільним гемоглобіном визначається гіпохромія, базофільні включення в еритроцитах, по краях еритроцитів виявляються виїмки у вигляді надкусів, обумовлених витяганням тілець Гейнца при попередніх проходженнях еритроцитів через синуси селезінки.

Лабораторні методи виявлення телець Гейнца засновані на інкубації свіжовзятого зразка крові з різними оксидантними| і суправітальними барвниками. Підтвердженням нестабільного гемоглобіну служить лабораторна проба, що полягає в інкубації гемолізату крові при 50 °С або додаванні 17 % ізопропанолу, яка завершується утворенням великї кількості осаду.

Носійство аномального нестабільного гемоглобіну виявляється гемолітичною анемією різної виразності. Патологія успадковується по аутосомно-домінантному типу, в ряді випадків можливі спонтанні мутації. Клінічно захворювання маніфестує жовтяницею, спленомегалією, виділенням темної сечі, частіше ці симптоми виникають в дитячому віці.

Рентгеноструктурний і стереохімічний аналізи дозволяють визначити такі характеристики: просторову структуру молекули, взаємодії типу гемоглобін, залежність спорідненості гемоглобіну до кисню від величини рН і взаємодії з ферментними системами, що знаходяться в мітохондріях і цитозолі.

Імуногематологічні тести необхідні для розпізнавання і диференціальної діагностики імунного гемолізу, обумовленого антиеритроцитарними антитілами, які по своїй серологічній| характеристиці є аглютинінами. Антиеритроцитарні антитіла можуть бути ізоімунними, що утворюються в процесі імунізації реципієнта еритроцитарними антигенами донора при несумісній трансфузії або імунізації вагітної антигенами еритроцитів плоду, що призводить до гемолітичної хвороби новонароджених. Антиеритроцитарні антитіла можуть бути аутоімунними: 1) теплові аглютиніни, реагуючі при температурі тіла і направлені проти власних еритроцитів хворого, 2) холодові аглютиніни, що реагують при низьких температурах і також направлених проти власних еритроцитів хворого. Алло- і аутоантитіла представлені імуноглобулінами типу G (IgG) і третього компоненту комплемента С3.

Для виявлення антитіл на поверхні еритроцитів застосовують антиглобулінову пробу Кумбса, засновану на здатності антитіл, отриманих при імунізації тваринних і направлених проти специфічних сироваткових білків людини, аглютинувати його еритроцити в тому випадку, якщо ці білки фіксовані на власних еритроцитах хворого – пряма проба. Проведення непрямої проби Кумбса має на меті виявлення в сироватці дослідженого хворого неповних антитіл до еритроцитів крові дослідженого донора.

Пряма проба Кумбса: готують серію розведеної антиглобулінової сироватки, до ним додають по 0,05 мл 5 % суспензії відмитих еритроцитів хворого в фізіологічному розчині, всі краплі перемішують скляною паличкою. Відмічають час появи аглютинації і титр проби. Пряма реакція Кумбса чітко корелює з кількістю молекул IgG і/або С3 і (менш чітко) з інтенсивністю руйнування еритроцитів хворого, тому позитивна пряма проба Кумбса характерна для аутоімунної гемолітичної анемії.

Непряма проба Кумбса проводиться в два етапи: перший етап – інкубують в термостаті при 37 °С впродовж 1,5 годин інтактні еритроцити, сумісні по антигенах системи АВ0 і Rh, з досліджуваною сироваткою, другий етап – інкубовані еритроцити досліджують, проводячи пряму пробу Кумбса. Позитивна пряма реакція Кумбса підтверджує наявність в сироватці хворого неповних антитіл до еритроцитів дослідженого донора.

Метод виявлення неповних холодових аглютинінів (модифікована проба Кумбса): кров беруть в пробірку з цитратом і поміщають на лід до відділення плазми. Потім плазму відділяють, еритроцити відмивають теплим (37 °С) фізіологічним розчином і досліджують з антиглобуліновою сироваткою. Реакція буває позитивною тільки в цільній сироватці або її перших розведеннях. Виявлення холодових аглютинінів в титрі вище 1:64 характерний для холодової форми аутоімунної гемолітичної анемії.

Метод виявлення двох фазних холодових аглютинінів при синдромі Доната-Ландштейнера. Гемолізін при цій патології здатний фіксуватися на еритроцитах при охолоджуванні, руйнування еритроцитів відбувається в теплі. Тому дослідження проводять в два етапи – з первинним охолоджуванням (фіксація) і наступним зігріванням (гемоліз).