11.1.2. Проба на фосфатазу

Качественная реакция. Метод основан на способности фермента фосфатазы расщеплять бариевую соль паранитрофенилфосфата при температуре 38 град. C, освобождая паранитрофенол, который окрашивает среду в желтый цвет.

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; плитка электрическая; баня водяная; ступка фарфоровая диаметром 7 - 9 см; цилиндр вместимостью 50 куб.см; воронка делительная вместимостью 250 куб.см; пробки корковые; капельница; воронки стеклянные диаметром 4 - 5 см; марля; бумага фильтровальная; вата стеклянная; бариевая соль паранитрофенилфосфата, насыщенный раствор; гидроксид натрия, раствор массовой концентрации 400 г/куб.дм (Д = 1,43 г/куб.см); хлорид магния, раствор массовой концентрации 5 г/куб.дм; ацетатный буфер рН 5,4; вода дистиллированная; пробирки из бесцветного стекла диаметром 10 мм, пипетка 1 куб.см.

Проведение испытания. Измельченную навеску, взятую из внутренней части изделия в количестве 20 г и взвешенную с точностью до 0,01 г, переносят в ступку и растирают, добавляя постепенно 50 куб.см дистиллированной воды. Полученную взвесь процеживают через двойной слой марли, а оставшуюся в марле навеску отжимают, затем вытяжку фильтруют через сухой складчатый фильтр и делят пополам. Одну часть (фильтрат 1) исследуют непосредственно, другую (фильтрат 2) переносят в коническую колбу, доводят до кипения и снова фильтруют - эта часть фильтрата является контрольной.

Для проверки активности фосфатазы в пробирку отмеривают 1 куб.см фильтрата 1, прибавляют 2 капли раствора хлорида магния массовой концентрации 5 г/куб.дм, 2 капли ацетатного буфера (рН 5,4) и 0,5 куб.см раствора бариевой соли паранитрофенилфосфата.

Для контроля во вторую пробирку отмеривают 1 куб.см фильтрата 2 и добавляют те же реактивы, что и в первую. Обе пробирки помещают на 1 ч в водяную баню или термостат при температуре 37 - 38 град. C.

Затем в обе пробирки добавляют по капле раствора гидроксида натра.

При достаточной тепловой обработке кулинарного изделия окраска в обеих пробирках не меняется. При недостаточной тепловой обработке - раствор желтеет.

Определение остаточной активности кислой фосфатазы

(количественное определение) ГОСТ 23231

Метод основан на фотометрическом определении в продукте интенсивности развивающейся окраски, зависящей от остаточной активности кислой фосфатазы, выраженной массовой долей фенола. Метод применяют в случае сомнения проверенности продукта.

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; потенциометр с погрешностью измерения +/-0,06 рН; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра; ультратермостат или водяная баня; воронки; колбы мерные вместимостью 500 и 1000 куб.см; пипетки градуированные на 1; 5; 10 куб.см; палочки стеклянные; пробирки; бумага фильтровальная; груша резиновая; кислота лимонная; цитрат натрия 5-водный; динатриевая соль фенилфосфорной кислоты, раствор массовой концентрации 2 г/куб.дм, свежеприготовленный; кислота трихлоруксусная, кристаллическая, растворы массовой концентрации 50 и 200 г/куб.дм; гидроксид натрия, раствор C (NaOH) = 0,5 моль/куб.дм; вода дистиллированная; фенол; толуол; вольфрамат натрия; сульфат лития 1-водный; кислота ортофосфорная плотностью 1,72 г/куб.см; кислота соляная, плотностью 1,19 г/куб.см; бром, натрий молибденовокислый.

Подготовка к испытанию. Цитратный буфер: в мерной колбе вместимостью 1000 куб.см в дистиллированной воде растворяют 13,88 г цитрата натрия и 0,588 г лимонной кислоты, доливают водой до метки и перемешивают, рН буфера 6,5. Затем добавляют 1 куб.см толуола. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 +/- град. C не более 12 сут.

Реактив Фолина: 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 куб.см дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 куб.см ортофосфорной кислоты и 100 куб.см соляной кислоты. Смесь осторожно кипятят в течение 10 ч в колбе вместимостью 2000 куб.см с обратным холодильником, после чего охлаждают и добавляют 150 г сульфата лития, 50 куб.см воды и несколько капель брома. Остаток брома отгоняют кипячением смеси без холодильника в вытяжном шкафу, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб.см, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Реактив должен быть золотисто-желтого цвета без зеленого оттенка; его хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте не более 6 мес.

Стандартный раствор: 2 г фенола (взвешивают с точностью до 0,001 г) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1000 куб.см, доводят объем до метки и перемешивают. Отбирают пипеткой с помощью резиновой груши 5 куб.см раствора в колбу вместимостью 500 куб.см, добавляют около 300 куб.см дистиллированной воды, вносят 25 г кристаллической трихлоруксусной кислоты. После растворения содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Полученный раствор содержит 20 мкг фенола в 1 куб.см.

Построение градуировочного графика. В пробирки вносят следующие объемы стандартного раствора: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб.см, что соответствует массе фенола: 0; 5; 10; 20; 30; 40 мкг. Доводят объем каждой пробирки до 2,5 куб.см, добавляя соответствующий объем раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/куб.дм (2,5; 2,25; 2,0; 1,5; 1,0; 0,5 куб.см) и перемешивают. В каждую пробирку добавляют 5 куб.см раствора гидроксида натрия, перемешивают, выдерживают 10 мин, добавляют 1,5 куб.см реактива Фолина, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:2 и перемешивают.

Через 30 мин измеряют оптическую плотность растворов по отношению к раствору трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/куб.дм на фотоэлектроколориметре с применением светофильтра с длиной волны 600 +/- 10 нм в кювете с расстоянием между рабочими гранями 10 мм или спектрофотометра при длине волны 600 нм в кювете аналогичного размера.

По полученным средним данным по трем стандартным растворам на миллиметровой бумаге размером 20 x 20 см строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают значение массовой доли фенола (микрограмм в 9 куб.см окрашенного раствора); на оси ординат - значение соответствующей оптической плотности (Д). Градуировочный график должен проходить через начало координат.

Рисунки должны быть выполнены сначала на миллиметровке и затем на кальке.

Пример градуировочного графика для определения массовой доли фенола с помощью фотоэлектроколориметра.

Градуировочный график для определения массовой доли фенола

с помощью фотоэлектроколориметра (пример)

*****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ

Проведение испытания. От объединенной пробы, подготовленной к испытанию, берут 2 навески массой по 1 г (с точностью до 0,001 г) и переносят в две пробирки (контрольную и опытную).

В пробирки вносят по 10 куб.см ацетатного буфера рН 6,5, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и настаивают в течение 20 мин при температуре 20 град. C, периодически перемешивая.

В контрольную пробирку добавляют 5 куб.см 200 г/куб.дм раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и добавляют 5 куб.см 2 г/куб.дм раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты, выдерживают 10 мин и фильтруют.

В опытную пробирку добавляют 5 куб.см 2 г/куб.дм раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и помещают в ультратермостат при температуре 39 +/- 1 град. C на 1 ч, затем добавляют 5 куб.см 200 г/куб.дм раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин и фильтруют.

Для проведения цветной реакции из контрольной и опытной пробирок отбирают по 2,5 куб.см безбелкового фильтрата. Цветную реакцию проводят по методу, описанному выше.

Массу фенола в навеске определяют по градуировочному графику.

Обработка результатов. Массовую долю фенола (X, %) вычисляют по формуле

6

X = [(m - m ) · 20 · 100] / m · 2,5 · 10 (89)

1 2

где m - масса фенола в опытной пробирке, найденная по

1

градуировочному графику, мкг;

m - масса фенола в контрольной пробирке, найденная по

2

градуировочному графику, мкг;

m - масса анализируемой пробы, г;

6

10 - коэффициент пересчета, г;

20 - разведение, см;

2,5 - объем фильтрата, отобранный для цветной реакции, куб.см.

Вычисление проводят до 0,0001.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допустимое расхождение между которыми при Р = 0,95 не должно превышать 10% по отношению к среднему арифметическому.

Окончательный результат определяют до 0,001.