Молекулярная эволюция рДнк амурского осетра Acipenser schrenckii и калуги Huso dauricus: данные частичного секвенирования гена 18s рРнк

1Рожкован к.В.,1Челомина г.Н.,2Иванов с.А.

1Биолого-почвенный институт дво ран, Владивосток 690022

2 Хабаровский филиал Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра, Хабаровск 680028, Россия

e-mail: chelomina@ibss.dvo.ru, amursturgeon@mail.ru

Гены ядерных рРНК являются удобным молекулярным маркером для филогенетических исследований эукариот на разных таксономических уровнях, т.к. большинство мутаций рДНК быстро фиксируются внутри популяции или вида в процессе дифференциации. Кроме вариабельных участков, последовательности имеют консервативные области, необходимые для универсальных праймеров и выравнивания. Интенсивное исследование этих маркеров обнаружило, что у небольшого числа организмов регистрируются 2-3 варианта ядерного гена 18SрРНК. Открытие множественных аллелей этого гена у северо-американских осетровых рыб (родAcipenser) оказалось еще более неожиданным. В настоящее время не существует четкого объяснения данного феномена, а также его отсутствия у ближайших филогенетических родственников осетров, таких как веслоносы (родPolyodon). Среди возможных причин чаще всего приводят полиплоидию; бесспорным остается лишь то, что механизмы согласованной эволюции последовательностей рДНК в геномах осетровых рыб не смогли реализоваться.

Цель нашей работы состояла в исследовании разнообразия рДНК у двух видов осетровых рыб Амура, амурского осетра Acipenser schrenckiiBrandt, 1869 и калугиHuso dauricus Georgi, 1775, что необходимо для прояснения механизмов согласованной эволюции ядерных генов рРНК и оценки широты распространения феномена множественного аллелизма этих генов среди осетровых рыб. Для этого последовательности гена ядерной 18SрРНК амплифицировали с использованием смеси ферментовTaqиPfu,PCR-продукты лигировали в векторpTZ57R/Tи клонировали. Продукты индивидуальных клонов секвенировали с помощью циклической реакции на автоматическом лазерном секвенатореABIPRISM310 (БПИ ДВО РАН). Полученные результаты объединяли с имеющимися данными изGenBank(поA. fulvescens,A.brevirostrum,A. ruthenus иA. sturio) и обрабатывали с помощью статистических программ (MEGA,Arlequin).

Всего нами получено 60 клонов с 486 пн вставкой гена ядерной 18SрРНК. Максимальное количество клонов и разных вариантов последовательностей от одной особи составило 30 и 12, соответственно, что указывает на возможность наличия в исследованных геномах большого числа вариантов рДНК. Для оценки вариабельности нуклеотидных последовательностей учитывали все типы замен, инсерции и делеции. Выявлено 58 вариабельных сайтов, 15 из которых являются парсимоний-информативными. Для последовательностей обоих видов осетров Амура основным типом замен были транзиции С-Т, что согласуется с данными поA. fulvescens.

Среди 22 клонов амурского осетра обнаружено 11 вариантов гена ядерной 18SрРНК, имеющих различия по 21 замене и 1 делеции. Из 38 клонов калуги выделено 13 вариантов последовательности рДНК, различающихся по 14 заменам и 11 делециям. Уровень изменчивости различных вариантов последовательности рДНК у анализируемых видов практически не отличался и варьировал в широком диапазоне: 0.2-3.7% уAcipenser schrenckii и 0.2-3.5% у Huso dauricus.Хотя верхний предел достаточно высок, он ниже межвидовых различийAcipenseriformes(примерно 5%), и почти такой, как уA. fulvescens(4%).

Филогенетический анализ (минимальное спениговое древо MS,NJдрево), выполненный для шести видов осетровых рыб, распределил все последовательности рДНК в два кластера с 3 основными аллельными вариантами (А, В и С). Различия варианта А с вариантами В (1.9%) и С (1.5%) существенно выше различий между вариантами В и С (0.4%). Количество мутационных шагов между двумя разными вариантами последовательностей наMSреконструкции варьировало от 1 до 15. Вариант А, составляющий основу первого кластера (32% проанализированных последовательностей), включал 12 последовательностейA. schrenckii, 11 –H. dauricus, 1 – A. sturioи функциональные гены A. fulvescens. Следовательно, не менее 40% последовательностей рДНК осетров Амура могут быть копиями функционального гена 18SрРНК. Варианты В и С являются центральными во втором кластере; они объединяют 12% и 7% от общего числа последовательностей соответственно, причем первый из них представляет рДНК только амурских видов осетров, а второй – североамериканских. Поскольку (согласно литературным данным) во второй кластер входят некодирующие последовательности A. fulvescensиA. brevirostrum,можно предположить, что рДНК осетров Амура, входящая в этот кластер также, представлены нефункциональными генами.

Таким образом, в геномах осетровых рыб Амура обнаруживается внутривидовая и внутри-индивидуальная изменчивость генов 18SрРНК. Хотя эти особенности осетров не позволяют использование рДНК для филогенетических исследований внутриAcipenseriformes, полученные данные могут быть использованы в анализе особенностей молекулярной эволюции этой древней группы рыб, названной "живыми ископаемыми".