Аспіраційний метод (апарат Кротова або ПАП-1)

• Найбільш точний кількісний метод.

• Через прилад проганяють певну об'ємну кількість повітря (наприклад, 100 або 250 л), спрямовуючи повітряний струмінь безпосередньо на агар у чашці Петрі.

• Після інкубації в термостаті (зазвичай при 37 °С протягом 18–24 годин) підраховують колонії та перераховують на 1 м³ повітря.

Критерії оцінки чистоти повітря закритих приміщень

Чистоту оцінюють за сукупністю показників (орієнтовні гігієнічні нормативи для палат лікарень, операційних або житлових кімнат):

• Для житлових приміщень:

  • Загальна кількість бактерій в 1 м³: чисте повітря — до 1500–2500 мікроорганізмів/м³.

  • Санітарно-показові бактерії (стафілококи та стрептококи) в житлових приміщеннях у нормі мають бути відсутніми або визначатися в мінімальних кількостях (залежно від призначення кімнати).

• Для операційних та асептичних палат:

  • До початку роботи загальна кількість мікробів в 1 м³ не повинна перевищувати 500 клітин/м³, а під час роботи — до 1000 клітин/м³.

  • Наявність золотистого стафілокока та гемолітичних стрептококів не допускається (0 в об'ємі проби).

144. Харчові отруєння мікробної етіології. Класифікація харчових отруєнь і збудників, які їх спричинюють.

Харчові отруєння мікробної етіології — це гострі захворювання, які виникають через вживання їжі, зараженої мікроорганізмами або їхніми токсинами.

Класифікація харчових отруєнь мікробного походження

Медична класифікація поділяє такі отруєння на три основні групи залежно від механізму дії збудника:

1. Бактеріальні токсикоінфекції

2. Бактеріальні токсикози (інтоксикації)

3. Мікотоксикози

1. Бактеріальні токсикоінфекції

Це отруєння, які виникають через масове потрапляння в організм живих бактерій разом із їжею. У кишечнику бактерії гинуть і виділяють небезпечні токсини.

• Особливість: Збудник розмножується в харчовому продукті у великій кількості, але часто не змінює його смаку чи запаху.

• Основні збудники:

  • Salmonella (Сальмонели) — містяться в м'ясі, птиці, яйцях і молоці.

  • Escherichia coli (Патогенні кишкові палички) — потрапляють через брудну воду та немиті овочі.

  • Proteus (Протей) — розвиваються у м'ясних та рибних стравах при порушенні умов зберігання.

  • Vibrio parahaemolyticus — зустрічаються в морепродуктах та рибі.

2. Бактеріальні токсикози (інтоксикації)

Це отруєння, що виникають через вживання їжі, яка вже містить готові токсини, що їх бактерії виділили під час розмноження в продукті. Самих живих бактерій у їжі може вже й не бути.

• Особливість: Токсини часто дуже стійкі до нагрівання і тримаються в їжі навіть після термічної обробки.

• Основні збудники:

  • Staphylococcus aureus (Золотистий стафілокок) — потрапляє в їжу від кухарів із гнійничковими ранами на руках або через молочні продукти (креми, молоко). Виділяє ентеротоксин.

  • Clostridium botulinum (Клостридії ботулізму) — живуть без доступу кисню. Утворюють найсильнішу отруту (ботулотоксин) у консервах, копченостях, в'яленій рибі чи домашніх закрутках.

3. Мікотоксикози

Це отруєння, які спричиняють токсичні речовини (мікотоксини), що їх виробляють плісеневі гриби на зіпсованих зернових, горіхах, овочах чи фруктах.

• Особливість: Грибки вражають продукти під час неправильного збирання або зберігання у вологості.

• Основні збудники (гриби):

  • Гриби роду Aspergillus (виділяють афлатоксини).

  • Гриби роду Fusarium.

  • Гриби роду Penicillium.

145. Збудники харчової токсикоінфекції. Принципи санітарно-бактеріологічних досліджень харчових продуктів.

Харчові токсикоінфекції (ХТІ) — це гострі інфекційні захворювання, що виникають через вживання їжі, яка масово містить умовно-патогенні чи патогенні бактерії та їхні токсини.

Збудники харчових токсикоінфекцій

• Представники родини Enterobacteriaceae: Escherichia coli (ентеропатогенні штами), Proteus vulgaris та Proteus mirabilis, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter.

• Неферментуючі бактерії: Pseudomonas aeruginosa.

• Грамопозитивні бактерії: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus (викликає переважно токсикоз), а також Streptococcus faecalis.

• Особливість: Мікроорганізми потрапляють у продукт, активно розмножуються в ньому і накопичують токсини, часто не змінюючи смаку чи вигляду їжі.

Принципи санітарно-бактеріологічних досліджень харчових продуктів

• Кількісний підрахунок (мікробне число): Визначення загальної кількості мікроорганізмів в 1 г або 1 мл продукту (КМАФВ — кількість мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів).

• Виявлення бактерій групи кишкових пачок (БГКП / коліформ): Індикатор фекального забруднення та низької санітарної якості їжі.

• Пошук патогенів та умовно-патогенних мікроорганізмів: Виділення чистих культур сальмонел, стафілококів, протею, бацил або клостридій з подальшою ідентифікацією за біохімічними та серологічними властивостями.

• Нормування: Порівняння отриманих результатів із чинними санітарними правилами і нормативами безпеки харчових продуктів.

146. Санітарна вірусологія, предмет, завдання, значення санітарної вірусології в діяльності лікаря

Санітарна вірусологія — це розділ медичної вірусології та гігієни, який вивчає поширення вірусів у навколишньому середовищі та їхній вплив на здоров'я людини.

Предмет санітарної вірусології

• Об'єкти довкілля: Вода (питна, стічна, відкритих водойм), ґрунт, повітря, харчові продукти та предмети побуту.

• Збудники: Патогенні та умовно-патогенні віруси для людини (ентеровіруси, ротавіруси, норовіруси, віруси гепатитів А і E, аденовіруси тощо), які потрапляють у довкілля з виділеннями людини чи тварин.

Основні завдання

• Виявлення вірусів: Індикація (знаходження) вірусів у зразках води, ґрунту чи їжі.

• Оцінка безпеки: Визначення епідемічної небезпеки об'єктів довкілля для населення.

• Контроль очищення: Перевірка ефективності роботи очисних споруд, систем водопостачання та методів дезінфекції.

• Прогнозування: Запобігання виникненню епідемічних спалахів вірусного походження (наприклад, кишкових інфекцій).

Значення в діяльності лікаря

• Профілактика: Допомагає лікарю розуміти шляхи передачі інфекцій (водний, аліментарний, контактно-побутовий) та планувати профілактичні заходи.

• Протиепідемічна робота: Дає змогу швидко встановити джерело та фактор передачі інфекції під час спалаху гострих кишкових інфекцій чи гепатиту А.

• Гігієнічні нормативи: Використання знань про стійкість вірусів у довкіллі для дотримання санітарно-епідемічного режиму в лікарнях, закладах харчування та водопровідних станціях.

147. Особливості біології вірусів.

Віруси — це неклітинні форми життя, які є обов'язковими внутрішньоклітинними паразитами та проявляють ознаки живого лише всередині клітин-хазяїв.

Основні особливості біології вірусів

• Неклітинна будова: Віруси не мають клітинної структури, а складаються з генетичного матеріалу та захисної оболонки.

• Відсутність власних систем синтезу білка та енергії: У вірусів немає власних рибосом, а також систем перетворення енергії чи обміну речовин, тому для розмноження вони використовують ресурси зараженої клітини.

• Наявність лише одного типу нуклеїнової кислоти: Їхній геном утворений або молекулою ДНК, або РНК (одно- чи дволанцюговими).

• Будова віріона (вірусної частки): Складається з серцевини (нуклеїнової кислоти) та капсида — білкової оболонки. Складні віруси додатково можуть мати ліпідну оболонку (суперкапсид) і ферменти.

• Специфічність: Віруси здатні взаємодіяти лише з певними рецепторами конкретних клітинних мембран, тому вони уражають суворо визначені види організмів або типи тканин.

• Перехідна форма: Поза межами живої клітини віріони перебувають у стані спокою, не виявляючи жодних ознак життя, але всередині клітини виявляють спадковість і здатність до самовідтворення (реплікації).

148. Місце вірусів серед автономних генетичних систем (віроїди, транспозони плазміди). Віруси бактерій (бактеріофаги).

Віруси займають особливе проміжне місце серед неклітинних форм життя та мобільних генетичних систем, поєднуючи ознаки біологічної молекули та живого організму.

Місце вірусів серед інших генетичних систем

Мобільні та автономні генетичні системи — це ділянки нуклеїнових кислот (ДНК або РНК), які можуть переносити інформацію або переміщуватися. Віруси відрізняються від них своєю будовою та можливостями:

• Віруси: Мають спадковий матеріал (ДНК чи РНК) і захисну білкову оболонку (капсид). Вони здатні виходити за межі однієї клітини й заражати іншу у вигляді самостійної частки — віріона.

• Віроїди: Це мінімальні інфекційні агенти. Вони складаються лише з голої кільцевої молекули РНК без білкової оболонки. Віроїди вражають переважно рослини.

• Плазміди: Малі кільцеві молекули ДНК, які зазвичай живуть всередині бактерій. Вони допомагають бактеріям набувати нових властивостей (наприклад, стійкості до ліків), але не утворюють самостійних оболонок для виходу назовні.

• Транспозони («стрибаючі гени»): Ділянки ДНК, які можуть переміщуватися з одного місця геному в інше всередині однієї клітини. Вони не мають власної оболонки і не існують поза клітиною.

Віруси еволюційно складніші за плазміди чи віроїди, бо мають власний білковий «скафандр» для передачі генетичної інформації.

Віруси бактерій (Бактеріофаги)

Бактеріофаги — це віруси, які заражають бактерії та архей. Їх часто називають «вбивцями бактерій».

• Будова: Зазвичай мають голівку (там лежить ДНК або РНК), хвостик і хвостові нитки. Нитки допомагають прикріпитися до стінки бактерії, а хвостик впорскує вірусну ДНК всередину клітини.

• Життєвий цикл (два шляхи):

  • Літичний цикл: Вірус швидко захоплює ресурси бактерії, створює свої копії, руйнує (лізує) клітину і виходить назовні, щоб заразити нові.

  • Лізогенний цикл: Вірусна ДНК ховається всередині ДНК бактерії і мовчить деякий час. Клітина ділиться, передаючи копію вірусу новим поколінням.

149. Структура віріону. Прості та складні віруси. Будова бактеріофагів

Віріон — це зріла позаклітинна вірусна частка, яка складається з генетичного матеріалу (ДНК або РНК) та захисної білкової оболонки.

Структура віріону

• Нуклеоїд (серцевина): генетичний апарат вірусу, представлений молекулою ДНК або РНК, що містить спадкову інформацію.

• Капсид: білкова оболонка, що захищає нуклеїнову кислоту від пошкоджень і складається з дрібних субодиниць — капсомерів.

• Нуклеокапсид: комплекс серцевини та капсиду.

Прості та складні віруси

• Прості віруси:

  • Складаються лише з нуклеїнової кислоти (серцевини) та капсиду.

  • Приклад: вірус тютюнової мозаїки, поліомієліт.

• Складні віруси:

  • Окрім нуклеокапсиду, мають додаткову зовнішню оболонку — суперкапсид (утворену з ліпідів і білків клітини-хазяїна), а також глікопротеїнові шипи.

  • Приклад: вірус грипу, герпесу, ВІЛ.

Будова бактеріофагів

Бактеріофаги — це віруси, що уражають бактеріальні клітини. Найскладнішу будову мають фаги кишкової палички (наприклад, Т4):

• Голівка: має кубічну або призматичну форму, всередині якої щільно упакована молекула ДНК або РНК. Оболонка складається з білків.

• Відросток: білкова трубка, що відходить від голівки і діє як шприц під час інфікування. Вона оточена скоротливим чохлом.

• Базальна пластинка: основа відростка, яка містить шипи та базальні (хвостові) нитки (фібрили). Вони забезпечують прикріплення фага до рецепторів на поверхні бактерії.

150. Вірусні білки. Структурні та неструктурні білки. Ферменти віріону та Вірус індуковані ферменти

Вірусні білки складають більшу частину маси віріону та кодуються вірусним геномом. За часом синтезу та роллю в інфекційному процесі їх поділяють на кілька великих груп.

Структурні та неструктурні білки

• Структурні білки:

  • Входять до складу зрілої вірусної частинки (віріону).

  • Формують капсид і суперкапсид (оболонки).

  • Захищають нуклеїнову кислоту від зовнішніх факторів.

  • Забезпечують прикріплення (адсорбцію) вірусу до клітинних рецепторів.

• Неструктурні білки:

  • Функціонують лише всередині інфікованої клітини-хазяїна.

  • Не входять до складу готового віріону.

  • Регулюють процеси реплікації вірусного геному та транскрипції.

  • Блокують захисні системи клітини (наприклад, синтез інтерферону).

Ферменти віріону та вірусіндуковані ферменти

Віруси не мають власного метаболізму, але мають специфічні ферменти для розмноження та проникнення в клітину.

• Ферменти віріону (конститутивні):

  • Знаходяться безпосередньо всередині або на поверхні зрілої вірусної частинки.

  • Потрапляють у клітину разом із геномом під час зараження.

  • Приклади: РНК-залежна РНК-полімераза (у РНК-вірусів), зворотна транскриптаза (ревертаза у ретровірусів, як-от ВІЛ), нейрамінідаза (на поверхні вірусу грипу для виходу з клітини).

• Вірусіндуковані ферменти:

  • Відсутні у віріоні, а кодуються вірусним геномом і синтезуються клітиною вже після інфікування.

  • Необхідні для масового копіювання вірусних компонентів.

  • Приклади: ДНК-полімераза вірусу герпесу, специфічні вірусні протеази (розщеплюють великі білки-попередники на функціональні структурні одиниці).

151. Вірусні нуклеїнові кислоти. Вірусні днк. Вірусні рнк плюс- та мінустипу

Вірусні нуклеїнові кислоти є носіями генетичної інформації вірусів і, на відміну від клітинних організмів, представлені лише одним типом — або ДНК, або РНК.

За класифікацією Балтімора, особливості структури та полярності нуклеїнових кислот визначають унікальний спосіб реплікації та синтезу білка для кожної родини вірусів.

Вірусні ДНК

ДНК-геномні віруси містять інформацію, кодовану у вигляді дезоксирибонуклеотидів. За структурою вірусні ДНК бувають:

• Дволанцюгові: найпоширеніша форма. Можуть бути лінійними (вірус герпесу, аденовіруси) або кільцевими (папіломавіруси).

• Одноланцюгові: рідкісна форма, представлена лінійними чи кільцевими молекулами (наприклад, парвовіруси).

• Особливості: більшість ДНК-вірусів копіюють свій геном у ядрі клітини-хазяїна, використовуючи її полімерази, за винятком поксвірусів (вірус віспи), які реплікуються в цитоплазмі завдяки власним ферментам.

Вірусні РНК: плюс- та мінус-типу

Для одноланцюгових РНК-вірусів критично важливим є поняття полярності (знаку ланцюга), що визначає, як саме вірус починає синтез білка після проникнення в клітину.

• Плюс-РНК (+РНК) віруси (позитивний геном):

• Вірусна РНК є інформаційною РНК (іРНК / мРНК).

• Після потрапляння в цитоплазму вона одразу розпізнається рибосомами клітини і транслюється у вірусні білки.

• Очищена +РНК, виділена з віріону, має інфекційні властивості сама по собі.

• Приклади: коронавіруси, вірус гепатиту С, пікорнавіруси (поліомієліт).

• Мінус-РНК (-РНК) віруси (негативний геном):

  • Вірусна РНК є комплементарною до мРНК, тому клітинні рибосоми не можуть безпосередньо зчитати з неї інформацію.

  • Для запуску інфекційного процесу вірус обов'язково повинен принести з собою у складі віріону власний фермент — РНК-залежну РНК-полімеразу (транскриптазу).

  • Цей фермент спочатку синтезує на матриці -РНК комплементарну їй +РНК (мРНК), і лише тоді починається біосинтез білків.

  • Приклади: вірус грипу, вірус сказу, вірус кору

152. Взаємодія вірусів з клітинами. Типи взаємодії. Етапи взаємодії.

Взаємодія вірусу з клітиною — це складний багатоетапний процес, який починається з контакту вірусної частинки з поверхнею клітини і завершується або загибеллю клітини та виходом нового покоління віріонів, або тривалим співіснуванням вірусу та клітини.

1. Типи взаємодії вірусу з клітиною

Залежно від наслідків для клітини та характеру репродукції вірусу виділяють три основні типи взаємодії:

• Продуктивна (літична) інфекція:

  • Вірус повністю реалізує свій геном.

  • У клітині масово утворюються нові віріони.

  • Клітина-хазяїн гине (руйнується шляхом лізису або апоптозу).

• Абортивна інфекція:

  • Переривається на одному з етапів через дефекти самого вірусу (дефектні віріони) або несприятливі умови в клітині (наприклад, клітина стійка або захищена інтерфероном).

  • Нові вірусні частинки не утворюються, клітина зазвичай виживає.

• Персистентна (інтеграційна або латентна) інфекція:

  • Вірусний геном вбудовується (інтегрується) в хромосому клітини (провірус) або існує в ній у вигляді епісоми (кільцевої ДНК).

  • Клітина продовжує жити і ділитися, передаючи вірусний геном нащадкам.

  • Приклади: ВІЛ, вірус герпесу, бактеріофаги (явище лізогенії). Окремим варіантом є трансформація — перетворення клітини на пухлинну (онкогенні віруси).

2. Етапи взаємодії вірусу з клітиною (продуктивний тип)

Процес репродукції вірусу складається з послідовних стадій:

І. Адсорбція (прикріплення)

• Вірусна частинка стикається з клітиною.

• Специфічні білки вірусу (ліганди) зв'язуються з чутливими молекулами на поверхні клітини (рецепторами). Процес має високу специфічність («ключ до замка»), що визначає тропізм вірусів до певних тканин.

ІІ. Проникнення у клітину

Відбувається двома основними шляхами:

• Ендоцитоз (віропексис): клітина сама поглинає вірус у складі ендосоми (характерно для простих і деяких складних вірусів).

• Злиття оболонок: суперкапсид складного вірусу зливається з плазматичною мембраною клітини, і нуклеокапсид потрапляє в цитоплазму (наприклад, ВІЛ, вірус грипу).

• (У бактеріофагів — ін'єкція нуклеїнової кислоти крізь клітинну стінку).

ІІІ. «Роздягання» (декапсидація)

• Видалення білкових оболонок (капсиду) вірусу за допомогою клітинних або вірусних протеолітичних ферментів.

• Звільнення вірусного геному (ДНК або РНК) для подальшої експресії.

IV. Ек eclipse-фаза (тіньова фаза / біосинтез)

На цьому етапі інфекційні вірусні частинки всередині клітини тимчасово зникають, оскільки відбувається:

• Транскрипція: синтез інформаційної РНК (мРНК) на матриці вірусного геному.

• Трансляція: синтез вірусних білків (ранніх ферментів та пізніх структурних білків) на рибосомах клітини.

• Реплікація: копіювання вірусного геному для майбутніх віріонів.

V. Збирання (морфогенез віріонів)

• Об'єднання синтезованих вірусних нуклеїнових кислот із структурними білками капсиду.

• У простих вірусів процес часто відбувається шляхом самозбирання в цитоплазмі або ядрі. У складних вірусів білки суперкапсиду спочатку вбудовуються в мембрани клітини.

VI. Вихід вірусів із клітини

• Вибуховий (лізис): клітина розривається, одночасно вивільняючи сотні віріонів (характерно для простих вірусів).

• Брунькування: складні віруси виходять поступово, «огортаючись» у ділянку модифікованої плазматичної чи внутрішньої мембрани клітини-хазяїна. Клітина деякий час залишається живою

153. Методи культивування вірусів.

Оскільки віруси є абсолютними внутрішньоклітинними паразитами, вони не здатні розмножуватися на штучних поживних середовищах (як бактерії). Для їхнього вирощування необхідні живі клітини.

У сучасній вірусології використовують три основні методи культивування вірусів.

1. Культури клітин (in vitro)

Це найсучасніший, найпоширеніший та технологічний метод. Клітини отримують шляхом подрібнення тканин тварин або людини та обробки їх ферментами (трипсином).

За здатністю до розмноження культури клітин поділяють на:

• Первинно-трипсинізовані (первинні): отримують безпосередньо з тканин (наприклад, нирки мавп, ембріони людини). Вони здатні ділитися лише обмежену кількість разів (до 5–10 генерацій) і швидко відмирають.

• Перещеплювані (стабільні / лінії пухлинних клітин): клітини, які зазнали трансформації та набули здатності ділитися нескінченно довго (безсмертні лінії). Приклади: HeLa (рак шийки матки людини), Vero (нирки зеленої мавпи), Hep-2 (рак гортані).

• Напівперещеплювані (диплоїдні): клітини ембріонів людини, які зберігають нормальний хромосомний набір і здатні витримувати до 40–50 поділів.

2. Курячі ембріони (в яйці)

Класичний, економічний і зручний метод, який найчастіше використовують для культивування вірусів грипу, герпесу та віспи, а також для виробництва деяких вакцин.

Використовують 9–12 денні живі курячі ембріони. Вірус заражають у різні ділянки залежно від його біологічних властивостей:

• На хоріон-алантоїсну оболонку (ХАО): для вірусів, що утворюють бляшки/віспини (вірус віспи, герпесу).

• В алантоїсну порожнину: найчастіше для вірусів грипу та парагрипу.

• В амніотичну порожнину: для первинного виділення вірусу грипу з клінічного матеріалу.

• У жовтковий мішок: для хламідій та деяких арбовірусів.

3. Лабораторні тварини (in vivo)

Найдавніший метод. Сьогодні його використання обмежене етичними нормами та високою вартістю, проте він залишається незамінним у деяких випадках.

• Хто використовується: білі миші (особливо сисуни), кролі, морські свинки, мавпи.

• Коли застосовують:

  • Для виділення вірусів, які погано ростуть у культурах клітин (наприклад, вірус сказу, вірус Коксакі).

  • Для вивчення патогенезу хвороби та оцінки імунного відклику.

  • Для перевірки безпечності та ефективності вакцин і противірусних препаратів.

154. Культивування вірусів на лабораторних тваринах. Методи зараження тварин, виявлення вірусів.

Культивування вірусів на лабораторних тваринах (метод in vivo) — це класичний підхід у вірусології. Його застосовують, коли вірус неможливо виростити в культурі клітин чи курячому ембріоні (наприклад, вірус сказу), для моделювання інфекційного процесу або для отримання діагностичних сироваток.

1. Вибір лабораторних тварин

Для роботи використовують тварин, чутливих до конкретного вірусу:

• Білі миші-сисуни (віком 1–3 дні) — найчутливіші до арбовірусів та вірусів Коксакі.

• Дорослі миші та щури — для вірусів сказу, кліщового енцефаліту.

• Морські свинки — для вірусу ящура, грипу.

• Кролі — для вірусу герпесу (модель кератиту), віспи, а також для отримання противірусних антитіл.

• Примати (мавпи) — використовуються вкрай рідко, переважно для вивчення ВІЛ/СНІД або поліомієліту.

2. Методи зараження лабораторних тварин

Вибір способу введення вірусного матеріалу залежить від тропізму вірусу (тобто від того, які органи й тканини він уражає в природних умовах):

• Інтрацеребральне (в головний мозок): використовують для нейротропних вірусів (сказ, енцефаліти). Тваринам під наркозом вводять матеріал крізь кістки черепа.

• Інтраназальне (в носову порожнину): для респіраторних вірусів (грип, аденовіруси). Матеріал закапують у ніздрі під легким ефірним наркозом, щоб тварина вдихнула вірус у легені.

• Нашкірне та внутрішньошкірне: матеріал втирають у скарифіковану (подряпану) шкіру рогівки кроля або шкіру спини (для вірусів віспи, герпесу).

• Внутрішньочеревне та підшкірне: для генералізованих інфекцій або з метою імунізації тварин для отримання сироваток.

• Внутрішньовенне: вводять у крайову вену вуха кроля або хвоста миші для швидкого потрапляння вірусу в кров.

3. Методи виявлення (індикації) вірусів у тварин

Про те, що вірус розмножився в організмі тварини, дізнаються за специфічними ознаками:

• Клінічні симптоми хвороби: розвиток паралічів, судом (при сказі), порушення координації рухів, відмова від їжі, скуйовджена шерсть.

• Загибель тварини: фіксують терміни смерті після зараження та розраховують летальну дозу вірусу.

• Патоморфологічні зміни органів: після розтину тварини досліджують уражені тканини. Наприклад, виявлення тілець Бабеша-Негрі в нейронах головного мозку при сказі або специфічних включень у клітинах дихальних шляхів при грипі.

• Індикація за допомогою лабораторних тестів: з тканин або крові тварини виділяють вірус і підтверджують його наявність за допомогою ПЛР (виявлення ДНК/РНК) чи серологічних реакцій (ІФА, РГГА).

155. Культивування вірусів на курячих ембріонах. Методи зараження і виявлення вірусів. Реакція вірусної гемаглютинації.

Культивування на курячих ембріонах (метод in ovo) — це класичний, високопродуктивний та економічний метод вірусології. Його найчастіше використовують для вирощування вірусів грипу, парагрипу, герпесу, віспи, а також для масового виробництва противірусних вакцин.

Для роботи використовують живі 9–12 денні ембріони з чистих птахогосподарств (без антитіл до вірусів), життєздатність яких попередньо перевіряють за допомогою овоскопії (просвічування виявляє рухи ембріона та пульсацію судин).

1. Методи зараження курячих ембріонів

Спосіб введення вірусного матеріалу залежить від біологічних властивостей (тропізму) конкретного вірусу:

• На хоріон-алантоїсну оболонку (ХАО):

  • Шкаралупу обережно пропилюють, роблять штучну повітряну камеру, щоб оболонка опустилася, і наносять вірус безпосередньо на ХАО.

  • Використовують для вірусів, що утворюють локальні ураження (вірус натуральної віспи, вірус простого герпесу).

• В алантоїсну порожнину:

  • Найпростіший і найпоширеніший метод. Матеріал вводять шприцом крізь отвір у шкаралупі в зону найбільшого скупчення алантоїсної рідини.

  • Використовують для масового розмноження вірусів грипу та парагрипу з метою отримання великого об'єму вірусовмісної рідини.

• В амніотичну порожнину:

  • Вірус вводять безпосередньо в навколоплідний мішок під контролем овоскопа.

  • Використовують для первинного виділення вірусу грипу з клінічного матеріалу людини (оскільки в амніоні є клітини, подібні до дихальних шляхів).

• У жовтковий мішок:

  • Голку вводять глибоко в центр яйця у вертикальному положенні.

  • Використовують для культивування хламідій, рикетсій та деяких арбовірусів.

Після зараження отвір у шкаралупі закривають парафіном або целулоїдним клеєм, а яйця інкубують при температурі 35–37°C протягом 48–72 годин.

2. Методи виявлення (індикації) вірусів в ембріонах

Оскільки віруси мікроскопічні, їхню присутність в ембріоні визначають за непрямими ознаками:

• Загибель ембріона (фіксується під час повторної овоскопії).

• Патоморфологічні зміни органів: відставання у розвитку, крововиливи (геморагії) на шкірі, набряки.

• Поява віспін (бляшок) на ХАО: утворення специфічних білуватих вузликів або вогнищ некрозу (характерно для вірусів віспи та герпесу).

• Позитивна реакція гемаглютинації (РГА): виявлення вірусів, що мають білок-гемаглютинін, в алантоїсній або амніотичній рідині.

3. Реакція вірусної гемаглютинації (рга)

Гемаглютинація — це процес склеювання та осадження еритроцитів під дією вірусів.

• Суть реакції: Деякі віруси (зокрема грип, парагрип, кір, аденовіруси) мають на своїй поверхні специфічні білки — гемаглютиніни. Вони здатні зв'язуватися з рецепторами на поверхні еритроцитів (людини або певних тварин, наприклад, курей, морських свинок). Один віріон може зв'язати між собою кілька еритроцитів, утворюючи велику тривимірну сітку (агрегат).

• Практичне значення: РГА є реакцією індикації, а не ідентифікації. Вона лише показує, що у досліджуваній рідині є вірус, але не каже, який саме (наприклад, вона покаже наявність вірусу грипу, але не визначить його штам).

• Як оцінюють результати (феномен «парасольки» та «ґудзика»):

  • Позитивна РГА (вірус є): еритроцити склеюються і рівномірно осідають на дні лунки планшета у вигляді рожевої сітки з нерівними краями — «парасольки».

  • Негативна РГА (вірусу немає): еритроцити не склеюються, вільно сповзають по закругленому дну лунки і збираються в центрі у вигляді чіткого щільного кола — «ґудзика».

156. Культура клітин у вірусології. Типи культур клітин. Умови культивування та середовища для культури клітин.

Культура клітин (культура тканин) — це метод вирощування соматичних клітин людини, тварин або рослин штучним шляхом in vitro (у лабораторному посуді). У сучасній вірусології це основний, найчутливіший та найбільш технологічний метод культивування вірусів.

1. Типи культур клітин

Залежно від походження клітин, їхнього хромосомного набору та здатності до тривалого розмноження, усі культури поділяють на три основні групи:

• Первинно-трипсинізовані (первинні) культури:

  • Отримують безпосередньо з тканин органів плода, ембріона або дорослого організму шляхом подрібнення та обробки ферментом трипсином для роз'єднання клітин.

  • Особливості: Зберігають диплоїдний набір хромосом, але мають обмежений потенціал життя — здатні ділитися лише від 5 до 10 разів (пасажів), після чого відмирають.

  • Приклади: Клітини нирок мавп, курячі або людські ембріональні фібробласти.

• Напівперещеплювані (диплоїдні) культури:

  • Це штами клітин людини або тварин (найчастіше ембріонального походження), які стабільно зберігають нормальний (диплоїдний) каріотип.

  • Особливості: Здатні витримувати значно більше поділів, ніж первинні — від 40 до 50 пасажів, зберігаючи при цьому високу чутливість до багатьох вірусів та безпечність для виробництва вакцин.

  • Приклади: Лінії клітин легень ембріона людини (WI-38, MRC-5).

• Перещеплювані (стабільні / постійні) культури:

  • Це лінії клітин, які зазнали генетичної трансформації (малігнізації) і набули здатності до безмежного, потенційно безсмертного поділу in vitro.

  • Особливості: Легко культивуються, швидко ростуть, мають змінений (гетероплоїдний) набір хромосом. За походженням вони переважно є пухлинними клітинами, тому їх не використовують для виробництва живих вакцин, але активно застосовують для діагностики.

  • Приклади: HeLa (рак шийки матки людини), Vero (нирки зеленої мавпи), Hep-2 (рак гортані людини), BHK-21 (нирки хом'яка).

За характером росту на склі чи пластику культури бувають моношаровими (клітини прикріплюються до дна посуду й ростуть в один шар) та суспензійними (клітини плавають і розмножуються в об'ємі рідкого середовища).

2. Умови культивування клітин

Для успішного росту та поділу клітин поза організмом необхідно суворо підтримувати специфічні фізико-хімічні параметри:

• Стерильність: Абсолютна вимога. Будь-яке бактеріальне або грибкове зараження знищує клітини, тому роботу проводять у ламінарних шафах з дотриманням правил асептики.

• Температура: Оптимальна температура для клітин ссавців становить 36,5–37 °C.

• pH середовища: Має підтримуватися у межах 7,2–7,4. Контроль здійснюють за допомогою індикатора (фенолового червоного): при закисленні середовища (накопичення продуктів метаболізму) воно жовтіє, при залужненні — стає малиновим.

• Газовий склад: Для підтримки буферної системи середовища клітини часто вирощують у CO₂-інкубаторах з умістом 5% вуглекислого газу.

3. Середовища для культури клітин

Поживні середовища забезпечують клітини всіма необхідними речовинами для життєдіяльності. Вони мають складний хімічний склад (амінокислоти, вітаміни, солі, глюкоза).

За призначенням поживни середовища поділяють на два види:

• Ростові середовища:

  • Використовують на початковому етапі для масового поділу клітин та формування суцільного моношару.

  • Містять підвищену кількість сироватки крові (наприклад, ембріональної телячої сироватки — FBS) у концентрації 10–20%. Сироватка забезпечує клітини факторами росту та гормонами.

• Підтримувальні середовища:

  • Застосовують після того, як моношар сформувався, безпосередньо під час зараження культури вірусом.

  • У них вміст сироватки знижують до 2–5% або повністю прибирають її. Це робиться для того, щоб сповільнити поділ самих клітин і не дозволити антитілам чи інгібіторам із сироватки заблокувати або нейтралізувати вірус.

Найпопулярніші комерційні середовища: Середовище 199, Ігла (MEM, DMEM), RPMI-1640. Для запобігання випадковому бактеріальному забрудненню до них обов'язково додають антибіотики (пеніцилін та стрептоміцин).