5. Методи мікроскопії.

Методи мікроскопії — це способи дослідження дрібних об'єктів за допомогою приладів, які збільшують зображення. Основні види: світлова мікроскопія, електронна мікроскопія та флуоресцентна мікроскопія.

Основні види мікроскопії

• Світлова (оптична) мікроскопія: використовує видиме світло і скляні лінзи для збільшення об'єктів до 2000 разів.

• Електронна мікроскопія: використовує пучок електронів замість світла, що дає величезне збільшення та дозволяє бачити віруси й органели.

• Флуоресцентна мікроскопія: використовує спеціальні барвники, які світяться під дією світла певного кольору.

 Розрізняють такі методи мікроскопії:

1) Бінокулярний мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами, це дає ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядається відразу двома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому досягається одночасна більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

2) Темнопольний мікроскоп(ультрамікроскоп) відрізняється від звичайного способом освітлення препарату.У звичайному мікроскопі об*єкт досліджується при світлі, яке проходить, в темнопольному – при боковому освітленні. Для цього звичайний конденсор Аббе замінюють спеціальним параболоїд-конденсором, у якому центральна частина нижньої лінзи затемнена, а бокова поверхня дзеркальна, в результаті чого утворюється темне поле зору. Мікроскопію в темному полі зору використовують для досл. рухливості бактерій, виявлення збудників лептоспірозу, сифілісу, поворотного тифу.

3) Фазово-контрасна мікроскопія – спосіб мікроскопічного дослідження прозорих, не поглинаючих світла об*єктів, який базується на підсиленні контрасту зображення. Він полягає в тому, що живі клітини, слабо поглинаючи світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникаючих променів.

4) Аноптральна мікроскопія. Є різновидом фозово-контрасного. він дає змогу досл. такі малоконтрасні живі об*єкти, як бактерії, гриби, найпростіші, але з більшою контрастністю, роздільною здатністю, стереоскопічністю і чіткістю зображення. Суттєвою деталлю аноптрального мікроскопа є спеціальна лінза об*єктива, яка розташована поблизу її верхнього отвору і на яку нанесено шар кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько 10% світла, яке проходить через об*актив і робить фон поля зору коричневим

5) Люмінесцентна мікроскопія – метод мікроскопії, який дозволяє спостерігати первинну або вторинну люмінесценцію (світіння0 мікроорганізмів, клітин, тканин обо окремих їх структур.Він базується на використанні явища флюоресценції Даний метод використовують для виявлення антигенів і антитіл.

6) Електронна мікроскопія. використовують електронний мікроскоп – високовольтний вакуумний прилад, у якому збільшення зображення отримують за допомогою потоку електронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис до 5 млн разів.

10.Виготовлення бактеріологічних препаратів. Барвники та допоміжні реактиви. Прості та складні методи фарбування.

Виготовлення бактеріологічних препаратів включає етапи приготування мазка (приготування краплі, розподіл матеріалу, висушування на повітрі та фіксація), використання анілінових барвників (основних і кислих) і допоміжних реактивів, а також застосування простих (одним барвником) та складних (кількома барвниками) методів фарбування.

Виготовлення бактеріологічних препаратів (мазків)

• Підготовка скла: знежирення та ретельне вимивання предметного скла.

• Нанесення матеріалу: внесення краплі води чи фізрозчину та розподіл бактеріальної культури петлею.

• Висушування: висушування мазка природним шляхом за кімнатної температури на повітрі.

• Фіксація: закріплення препарату (найчастіше у полум'я спиртівки або хімічними речовинами), щоб мікроорганізми не змивалися водою.

Барвники та допоміжні реактиви

• Основні барвники: генціановий фіолетовий, кристал віолет, метиленовий синій, основний фуксин.

• Кислі барвники: еозин, кіслий фуксин, конго родинний (фарбують переважно фоновий простір).

• Допоміжні реактиви: розчин Люголя (як провідник/морилка), спирт етиловий (для знебарвлення), розчини кислот, вода дистильована.

Прості та складні методи фарбування

• Простий метод: використання лише одного барвника (наприклад, метиленового синього) для визначення загальної форми та розміру клітин.

• Складний метод: застосування двох і більше барвників для диференціації мікроорганізмів за їх хімічними властивостями чи структурами.

• Метод Грама: диференціація бактерій на грампозитивні (темно-фіолетові) та грамнегативні (рожево-червоні).

• Спеціальні методи: забарвлення спор (метод Віртца-Конкліна), капсул або джгутиків.

Виготовлення препаратів-мазків з культури, що виросла на твердому середовищі. На знезаражене предметне скельце бактеріологічною петлею наносять краплю 0,9% розчину хлориду натрію (фізрозчину). Після повторної стерилізації петлі, із пробірки зі скошеним агаром набирають невелику кількість культури, яку наносять біля ізотонічного розчину хлориду натрію, і поступово розтираючи його по склу та емульгуючи в краплі, готують тонкий, рівномірний мазок округлої чи овальної форми. 

Виготовлення препаратів-мазків з культури, яка виросла на рідкому середовищі. Бактеріологічною петлею набирають краоплю рідкого живильного середовища, в якому ростуть мікроорганізми, із додержанням правил стерильності. Торкаються петлею центра предметного скла і роблять рівномірний тонкий мазок. Якщо для забору матеріалу використовують пастерівську піпетку, то її також тримають у правій руці та прожарюють у полум’ї перед внесенням у пробірку. Після попадання в піпетку рідкого середовища з мікробами, верхній кінець її закривають вказівним пальцем правої руки, виймають з пробірки, проносять її відкритий кінець над полум’ям пальника. На поверхню скельця випускають краплю середовища. Стерильною бактеріологічною петлею роблять мазок. 

Виготовлення препаратів для дослідження мікроорганізмів у живому середовищі. Для цього викор. методи *висячої* та *роздавленої* краплі. Препарат для *висячої* краплі готують на покривному скельці, на яке наносять краплю бульйонної культури мікроорганізмів. Якщо вик. культура яка виросла на агарі, спочатку на скельце наносять стерильну краплю фізрозчину, потім у нього стерильною петлею вносять культуру мікробів. Спеціальне предметне скельце з лункою, края якої попередньо змащені вазеліном, притуляють до покривного скельця з краплею так, щоб вона знаходилась у центрі лунки, і перевертають препарат покривним скельцем догори. Якщо препарат виготовлено правильно, то крапля вільно звисає у лунку, не торкаючись її поверхні. Препарат *роздавленої* краплі відрізняється тим, що краплю готують на звичайному знежиреному предметному склі, а потім покривають її покривним скельцем, стежачи за відсутністю бульбашок повітря. Мазок перед забарвленням висушують на повітрі або над полум*ям пальника і фіксують після повного висихання. Фіксаці. проводять у полум*ї пальника, тричі вносячи скельце через полум*я. Зафіксований препарат кладуть на спеціальну підставку над лотком, наносять барвник. Після забарвлення препарат промивають водою, висушують і мікроскопують. 

Найчастіше використовують основні барвники : фуксин основний, нейтральний червоний, конго червоний, метиленовий та толуїдиновий синій, генціатвіолет, метиленовий фіолетовий, хризоїдин, везувін, брильянтовий зелений, малахітовий зелений. При простих методах фарбування вик один барвник,при складних – два і більше. Складні методи фарбування: Метод Грама вик. для виявлення тинкторіальних властивостей, поділ м/о на грам позитивні і грамнегативні ( генціанвіолет 1-2 хв, р-н Люголя 1хв, спирт, вода, р-н фуксину 1-2 хв, вода, висушування та мікроскопія). Грам позитивні – темно фіолетові, грам негативні- червоні. Метод Ціля-Нільсена поділ на кислотостійкі і нестійкі (фуксин, вода, в сірчану кислоту 2-3 рази, вода, 3-5 хв метиленовий синій, вода, висушування і мікроскопування). Кислотостійкі – червоні, нестійкі – голубі. Метод Буррі-Гінса (виявлення капсул) – фіксують, промивають водою, забарвлюють фуксином або тіоніном, промивають водою, висушують, мікроскопують. На темному фоні забарвлені в червоний або синій колір мікроорганізми, оточені світлим ободком – капсулою. Метод Ожешка (спори) – 0,5% хлористоводневої кислоти, підігрівають 1-2 хв, промивають водою, фіксують, забарвлюють за методом Цілля. Спори червоного кольору, а тіла клітин – голубого. Метод Нейссера (включення) – 1-2 хв оцтовокислий метиленовий синій, р-н Люголя на 10-30 с., вода, хризоїдин 1хв, вода, висушують.Тіла бактер клітин – блідо жовті, зерна волютину – темносиній.