Самостоятельная работа студентов Работа 1. Количественное определение активности липазы в панкреатическом соке.

Работа позволяет качественно обнаружить наличие липазы в панкреатическом соке и дать количественную оценку ее действия.

Принцип метода. Метод основан на нейтрализации щелочью жирных кислот, образующихся при гидролизе жира ферментом липазой. Активность липазы определяется так называемым "липазным числом", т.е. количеством мл 0,1 н раствора КОН, идущего на нейтрализацию свободных жирных кислот, образующихся в результате гидролиза жира молока под влиянием 1 мл ферментного раствора.

Ход работы. Отмерить в 2 пробирки по 4 мл молока, 5-8 капель фенолфталеина и добавить одинаковое количество 0,1н раствора КОН до появления красной окраски (щелочь нейтрализует всю кислотность молока). После этого в одну пробирку добавить 2 мл предварительно прокипяченного панкреатического сока, в другую - некипяченого. Обе пробирки сверху залить 0,5 мл толуола для защиты от поглощения СО2 и поместить в термостат при 38°С на 30 мин. По истечении указанного времени пробирки вынуть, охладитъ и отметить обесцвечивание в пробирке с активным ферментом (щелочь нейтрализуется образующимся в результате гидролиза органическими кислотами). Содержимое этой пробирки оттитровать 0,1н раствором КОН до одинаковой окраски со второй пробиркой.

Расчет. Для определения липазного числа надо количество мл 0,1н раствора КОН, пошедшего на титрование, разделить на 2, т.е. на число мл ферментного раствора, взятого в опыт.

Работа 2. Количественное определение триацилглицеринов в сыворотке крови.

Принцип метода. Триацилглицерины (ТАГ) омыляются гидроксидом калия с образованием глицерина, при окислении которого образуется формальдегид. Реактив, содержащий ацетилацетон взаимодействует с формальдегидом с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого определяют фотометрически.

Ход определения. ТАГ определяют, внося реактивы в 3 пробирки с притёртой пробкой в следующей последовательности табл. 30:

Таблица 30

Компоненты		Раствор, мл
	Опытная проба	Эталонная проба	Контрольная проба
Сыворотка крови, мл	0,1	-	-
Эталонный раствор триолеина, мл	-	0,1	-
Дистиллированная вода, мл	-	-	0,1
Изопропанол, мл	4	4	4
	Перемешивают и добавляют мерной ложечкой адсорбент, г
	0,4	0.4	0,4
	Встряхивают на смесителе в течение 15 мин
	Центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин
Надосадочная жидкость, мл	2	2	2
Раствор КОН, мл	0,5	0,5	0,5
	Инкубируют в водяной бане при 60оС в течение 15 мин
	Охлаждают в холодной воде
Окислительный раствор, мл	0,5	0,5	0,5
	Оставляют на 10 мин при комнатной температуре
Реактив на формальдегид (ацетилацетон), мл	0,5	0,5	0,5
	Инкубируют в водяной бане при 60оС в течение 30 мин

После охлаждения измеряют оптическую плотность опытной (Е_о) и эталонной (Е_э) проб против контрольной пробы на ФЭКе при длине волны 410 нм в кюветах на 10 мм.

Расчёт. Содержание ТАГ рассчитывают по формуле: Х (ммоль/л)=Е_о/Е_э×3,39.

В норме содержание ТАГ в сыворотке крови составляет 0,45-1,85 ммоль/л или 0,5-1,5 г/л.

Наибольшее значение имеет определение ТАГ для установления типа наследственной гиперлипидемии (ІІб тип). Повышение содержания ТАГ бывает при геморрагической лихорадке, нефротическом синдроме, алкоголизме, гипотиреозе и др.