Работа 4. Метод определения кальция по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина.

Принцип метода. Мурексид образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина.

Ход определения. В 0,3 мл воды вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда же добавляют 3 мл мурексидглицеринового реактива.

1) перемешивают и через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 490 нм против холостой пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки берут воду. Одновременно ставят калибровочную пробу, в которую вместо сыворотки берут 0,1 мл калибровочного раствора.

Расчет производят по калибровочному графику.

1) Мурексидглицериновый реактив: 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н. КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина.

Работа 5. Определение времени свертывания крови (метод Мас и Магро).

Ход работы. На часовое стекло. Покрытое тонким слоем парафина, наливают большую каплю вазелинового масла. Производят укол в мякоть пальца, насасывают каплю крови в капиллярную пипетку Сали (20 мм³) и тотчас выдувают её в каплю масла на часовом стекле. Этот момент считается началом исследования. Каждые 2 минуты кровь вновь высасывают в пипетку Сали. Пока кровь не свернулась, она может быть набрана в пипетку. Определение производится при температуре 15-20^о С. При применении этого метода свертывание крови здорового человека происходит в течение 6-10 минут.

Работа 6. Определение времени рекальцификации плазмы.

Для диагностики нарушений свертывания крови широко используется определение времени рекальцификации плазмы, т.е. время образования фибрина в оксалатной или цитратной плазме после добавления к ней хлористого кальция.

Ход работы. К 0,2 мл хлористого кальция в пробирке добавляют 0,1 мл физиологического раствора. Смесь выдерживают в течение 60 секунд на водяной бане при 37^оС, а затем добавляют к ней 0,1 мл испытуемой оксалатной или цитратной плазмы (1 часть консерванта на 4 части крови).

Время появления хлопьев фибрина, или сгустка, является временем рекальцификации. В норме время рекальцификации составляет 1–2 мин. Время рекальцификации по своему значению эквивалентно времени свертывания крови.

Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний

1. 2

2. 3

3. 1-Б; 2-А; 3-В.

4. 1-Б; 2-В; 3-Г; 4-Д; 5-А.

5. Е(1,2,3,4)

6. А(1,2,3) 7. В (верно, верно, не верно)

8. Е (не верно, не верно, не верно)

Эталоны тветов ситуационных задач

Задача 1.

Поступивший в организм витамин К (нафтохинон) восстанавливается в печени НАДФН-зависимой витамин К-редуктазой с образованием дигидрохинона витамина К, служащего коферментом глутамат-карбоксилазы, катализирующей карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты в проферментах прокоагулянтного пути (ф.II, VII, IX,X) в гамма-карбоксиглутаминовую. Остатки гамма-карбоксиглутаминовой кислоты в факторах IIa,VIIa, IXa,Xa обеспечивают их взаимодействие посредством ионов Са с отрицательно заряженными фосфолипидами клеточных мембран и другими белками

Факторы VIIa, IXa участвуют в превращении ф.X →Xa (I фаза), фХа – в превращении ф.II→ IIa, а последний – в III фазе – образовании фибрина. Таким образом, витамин К в процессах гемокоагуляции непосредственного участия не принимает и, следовательно, его структурные аналоги дикумарол и варфарин не могут тормозить свертывание крови в пробирке.

Задача 2.

Эритроциты лишены митохондрий, поэтому в качестве энергетического материала они могут использовать только глюкозу, метаболизм которой представлен анаэробным гликолизом, пентозофосфатным путем окисления глюкозы. Около 90% поступающей глюкозы используется в гликолизе, остальные 10% - в пентозофосфатном цикле. АТФ, образующийся в анаэробном гликолизе, обеспечивает работу Na,K-ATФ-азы и поддержание самого гликолиза. Гликолитический НАДН является коферментом метгемоглобинредуктазы, катализирующей восстановление метгемоглобина до гемоглобина. Пируваткиназа – ключевой фермент гликолиза, катализирующий реакцию гликолитического фосфорилирования, обеспечивающую эритроцит АТФ:

Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат → Фруктозо-6-фосфат → Фруктозо-1,6-бисфосфат → Триозофосфаты → Фосфоэнолпируват + АДФ → Пируват + АТФ.

Недостаток пируваткиназы (наследственный) приводит к тяжелой анемии. Генетический дефект ферментов гликолиза приводит к уменьшению образования АТФ и НАДН в эритроцитах. Вследствие снижения скорости синтеза АТФ падает активность Na,K-ATФ-азы, повышается осмотическое давление и возникает осмотический шок. Дефицит НАДН приводит к накоплению метгемоглобина и увеличению образования активных форм кислорода – инициаторов ПОЛ в мембране эритроцитов, что также способствует их гемолизу.