3.2. Как в фармации используются иммобилизованные ферменты?

1. В автоматическом анализе биосубстратов и лекарственных веществ

2. В иммуноферментном анализе

3. В синтезе лекарств в химико-фармацевтической промышленности

4. В генно-инженерной биотехнологии лекарственных средств

5. В биотехнологии иммунопрепаратов

3.3. В чем преимущества ферментного анализа перед химическим в фармпроизводстве?

1. безвредность

2. высокая специфичность

3. применение небольшого количества реактивов

4. низкая специфичность

5. применение большого количества реактивов

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите

наличие причинной связи между ними. Утверждения разделены союзом

«потому что».

Выберите А, если оба утверждения верны и логически взаимосвязаны

Б, если утверждения верны, но не взаимосвязаны

В, если верно только первое утверждение

Г, если верно только второе утверждение

Д, если оба утверждения не верны

4.1 При действии фосфакола уменьшается количество ацетилхолина в синаптической щели, потому что происходит фосфорилирование фосфаколом он –группы серина в активном центре холинэстеразы.

4.2 Активность ферментов в присутствии ингибиторов может быть снижена, потому что в присутствии конкурентных ингибиторов возникают конформационные изменения молекул ферментов.

Примеры ситуационных задач

Задача 1.

Проанализируйте данные экспериментов по определению скорости ферментативной реакции при различных концентрациях субстрата, а также в присутствии ингибитора. По имеющимся данным постройте график Лайнуивера–Берка, определите Кm фермента и тип ингибирования.

Таблица 15

Концентрация субстрата, М	Скорость реакции, мкмоль/мин	Скорость в присутствии ингибитора, мкмоль/мин
610-6 110-5 210-5 610-5 1,810-4	20,8 29 45 67,6 87	4,2 5,8 9 13,6 16,2

Задача 2.

Фермент (10мкг) с молекулярной массой 500000 г/моль превращает 9,6 мкмоль субстрата в минуту при t 25С. Подсчитайте число оборотов.

Задача 3.

Сколько граммов субстрата с молекулярной массой 672 г/моль может преобразовать фермент, если его активность составляет 5нКат, а время инкубации – 20 сек.

Задача 4.

Проанализируте график Лайнувивера-Берка. Определите Кm, Vmax, и тип ингибирования.

Самостоятельная работа студентов

Методы количественного определения активности

некоторых ферментов

Работа 1. Количественное определение активности амилазы слюны

по Вольгемуту.

Амилаза (диастаза)- фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы (химизм реакции см. занятие№6). Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой слюнные и поджелудочная железы. Амилаза содержится также и в крови, куда попадает, главным образом, из поджелудочной железы.

Принцип метода. Метод основан на том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и тоже количество раствора крахмала и находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала. Затем производят перерасчет активности фермента на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны или амилокластичекая сила слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в мл, которое может расщепляться 1 мл слюны при температуре 38⁰ в течении 30 мин.

В норме амилазная активность слюны составляет 160-320 ед.

Ход работы. В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В 1 пробирку добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз. Содержимое пробирки перемешивают и 1 мл раствора переносят из 1 пробирки во 2, перемешивают и из второй – таким же образом в 3 и т.д. до 10 пробирки. Из 10 пробирки 1 мл смеси выливают. Таким образом, получается ряд разведенной слюны, в котором в каждой последующей пробирки содержится фермент вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешивают и помещают пробирки в термостат на 30 мин при температуре 38⁰.

Через 30 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 1-2 капле 1% раствора йода и перемешивают. Жидкость в пробирках в зависимости от степени расщепления крахмала может окрашиваться в желтый, розовый, красный и фиолетовый цвет. Раствор желтого цвета свидетельствует о полном расщеплении крахмала, фиолетовый – о том, что крахмал в растворе еще сохранился.

Работу необходимо оформить в виде табл. 16.

Таблица 16

Разведение слюны Кол-во 0,1% крахмала Окрашивание йодом Амилокластическая активность слюны	№ пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9

Расчет. Берется количество слюны в последней пробирке с желтой окраской. Если это четвертая пробирка, то разведение слюны в ней – 160 раз. Составляется пропорция: 1). 160 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1% р-ра крахмала; 2) 1 мл слюны расщепляет Х мл 0,1% р-ра крахмала.

Работа 2. Фотоколориметрический метод исследования активности

лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку.

Принцип метода. Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови. Пируват с 2,4- динитрофенилгидразином образует соответствующий гидразон, имеющий красно-бурое окрашивание в щелочной среде, интенсивность которого прямо пропорциональна содержанию кетокислоты:

пвк 2,4-динитрофенолгидразин

2,4-динитрофенолгидразон ПВК

Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД ⁺ и ставят на 5 мин в водяную баню при 37⁰С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 37⁰С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл раствора гидроксида натрия, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1см. Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможных причинах изменений активности фермента.

Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8- 4,0 ммоль/ (ч л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.