Работа 2. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле.

Принцип метода. Диск-электрофорез (от английского «discontinuous»-прерывистый) представляет собой метод разделения, в котором используется неоднородная («прерывистая») разделяющая система с полиакриламидным гелем в качестве носителя. Полиакриламидный гель представляет собой сополимер акриламидных и бисакриламидных мономеров.

В отличие от электрофореза, где применяется однородная буферная система с постоянным значением pH, при диск-электрофорезе используют пары буферов разного состава и различными значениями pH, а носитель состоит из отдельных слоев геля, отличающихся друг от друга по размерам пор. Благодаря этому разделяемые вещества концентрируются сначала в очень узкой стартовой зоне, что очень важно для четкого разделения смеси.

Разделение белков при этом методе происходит в небольших цилиндрических колонках полиакриламида. В продаже имеются несколько типов приборов для выполнения этого метода.

В настоящее время в основном используется прибор для аналитического электрофореза в полиакриламидном геле производства фирмы «Реанал» (Венгрия).

Основные части этого прибора:

1.Стеклянные трубки для геля и подставки для них. Колонки геля готовят в стеклянных трубках, имеющих длину 100 мм и внутренний диаметр 6 см.

2. Прибор для электрофореза, состоящий из верхнего и нижнего резервуаров для буферного раствора. В центре каждого резервуара в цилиндрическом патроне помещается угольный электрод, который вместе с патроном можно извлечь из резервуара. В стенке патрона сделаны отверстия для постоянного контакта электродов с буферным раствором независимо от его уровня. Снизу ко дну верхнего резервуара крепят 12 стеклянных трубок, заполненных гелем. Они размещаются на равном расстоянии от электрода по кругу. Прибор позволяет исследовать одновременно 12 образцов.

Ход работы. Работа состоит из нескольких последовательных операций:

1. Приготовление геля. Стеклянные трубки закрепляют в подставке. В каждую из них пипеткой вносят по 2 мл раствора мономеров и сшивающего вещества для приготовления мелкопористого геля определенных концентраций и сверху наслаивают несколько капель дистиллированной воды. Полимеризация при действии ультрафиолетовых лучей наступает примерно через 30-35 минут.

2. Нанесение сыворотки крови. Сыворотку крови (3-4 мкл) смешивают с 0,15 мл 40% раствора сахарозы и осторожно наслаивают на поверхность каждой колоночки геля.

3. Электрофорез. После внесения пробы трубки заполняют буферным раствором и монтируют ко дну верхнего резервуара. В каждый резервуар заливают по 1 мл соответствующего буферного раствора (pH 8,9). Камеру для электрофореза подключают к источнику постоянного тока (стабилизатор) и включают прибор. Во избежание нагревания геля и изменения физико-химических свойств белков желательно работающий прибор помещать в холодильник. Разделение белков сыворотки крови продолжается 60-120 мин. По окончании электрофореза трубки вынимают из прибора.

4. Извлечение колонок геля и окрашивание белковых фракций. Для извлечения геля из трубок в основном пользуются шприцем с иглой из нержавеющей стали (№ 20 длиной 8 см). Иглу вводят между стеклом и гелем, при нагревании воды осторожными движениями отделяют гель и выталкивают его из трубки. Белковые фракции окрашивают раствором красителя амидового черного. Избыток красителя отмывают несколькими порциями 7% раствора уксусной кислоты.

5. Количественное определение отдельных фракций проводят оптическими методами – прямой денситометрией или денситометрией фотоснимков. При диск-электрофорезе сыворотки в полиакриламидном геле можно получить около 30 отдельных фракций белков.