5.1. Установите последовательность операций при определении первичной структуры белка.

1. Фрагментация белков молекулы на более мелкие пептиды методами избирательного гидролиза.

2. Полный кислотный гидролиз белка.

3. Хроматографическое разделение смеси, идентификация и количественное определение аминокислот.

4. Последовательное отщепление и идентификация N-концевой аминокислоты.

Примеры ситуационных задач Задача 1.

Брадикинин – биологически активный пептид с коротким временем полужизни (20-30 сек.). Брадикинин расслабляет гладкую мускулатуру мышц, стимулирует сокращение мускулатуры бронхов, увеличивает проницаемость сосудистой стенки. Структура брадикинина Арг – Про –Про – Глу – Фен – Сер – Про – Фен – Арг.

Укажите аминокислоты или пептиды, которые будут образовываться после обработки этого нанопептида следующими агентами – карбоксипептидазой, химотрипсином, трипсином, динитрофторбензолом.

Задача 2.

Подавляющее большинство протеиногенных аминокислот дают синее окрашивание с нингидрином, а пролин и оксипролин – желтое. Объясните это различие, принимая во внимание химизм нингидриновой пробы и особенности структуры протеиногенных аминокислот.

Задача 3.

После процедуры гидролиза β-эндорфина и последующей идентификации смеси аминокислот методом хроматографии установлен аминокислотный состав β-эндорфина: тир(1), гли (3), фен (3), мет, тре (3), сер (2), лиз(5), глн (2), про, лей (2), вал (2), асн (2), ала(2), илей, гис и глу.

Обработка карбоксипептидазой высвобождает глутамин, динитрофторбензолом − тирозин. После обработки трипсином в смеси обнаруживаются следующие пептиды и аминокислоты:

лиз, гли–глн, асп - ала - илей - вал, лиз,

тир - гли – гли - фен - мет – тре - сер – глу - лиз,

асн-ала-гис-лиз, сер-глн-тре-про-лей-вал-тре-лей,фен-лиз.

Обработка химотрипсином высвобождает:

лиз-асн-ала-илей-вал-лиз-асн-ала-гис-лиз-лиз-гли-глн,

тир-гли-гли-фен,

мет-тре-сер-глу-лиз-сер-глн-тре-про-лей-вал-тре-лей-фен.

Какова первичная структура β-эндорфина ?

Работа 1. Разделение смеси аминокислот методом восходящей хроматографии на бумаге.

Принцип метода. Распределительная хроматография основана на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях. Один из двух растворителей должен быть полярным (подвижная фаза), а другой – неполярным, (неподвижная фаза). Более гидрофобная аминокислота, лучше растворяющаяся в неполярном растворителе, движется с меньшей скоростью, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого аминокислоты по окончании хроматографического разделения оказываются на разном расстоянии от линии старта.

Методика. На конец полоски хроматографической бумаги нанести микропипеткой каплю смеси аминокислот (гистидина и лейцина). Каплю высушить. В пробирку налить 1-2 мл растворителя (смесь н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5), затем полоску хроматографической бумаги с нанесенной на нее смесью аминокислот опустить в пробирку до соприкосновения с растворителем и закрыть пробкой.

Через 1 час вынуть полоску бумаги, отметить уровень движения растворителя, просушить бумагу на воздухе. Смочить 0,5% раствором нингидрида в ацетоне, снова просушить на воздухе и поместить на 5-10 минут в термостат, при температуре 55-60^o С. Отметить появление окрашенных пятен аминокислот – гистидина и лейцина. Рассчитать R_f для каждой аминокислоты.

R_f (коэффициент распределения) - отношение расстояния пройденного аминокислотой к расстоянию фронта растворителя.