Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
praktikum-po-bx-versiya-3.doc
Скачиваний:
6
Добавлен:
07.05.2019
Размер:
5.91 Mб
Скачать

5.1. Установите последовательность операций при определении первичной структуры белка.

1. Фрагментация белков молекулы на более мелкие пептиды методами избирательного гидролиза.

2. Полный кислотный гидролиз белка.

3. Хроматографическое разделение смеси, идентификация и количественное определение аминокислот.

4. Последовательное отщепление и идентификация N-концевой аминокислоты.

Примеры ситуационных задач Задача 1.

Брадикинин – биологически активный пептид с коротким временем полужизни (20-30 сек.). Брадикинин расслабляет гладкую мускулатуру мышц, стимулирует сокращение мускулатуры бронхов, увеличивает проницаемость сосудистой стенки. Структура брадикинина Арг – Про –Про – Глу – Фен – Сер – Про – Фен – Арг.

Укажите аминокислоты или пептиды, которые будут образовываться после обработки этого нанопептида следующими агентами – карбоксипептидазой, химотрипсином, трипсином, динитрофторбензолом.

Задача 2.

Подавляющее большинство протеиногенных аминокислот дают синее окрашивание с нингидрином, а пролин и оксипролин – желтое. Объясните это различие, принимая во внимание химизм нингидриновой пробы и особенности структуры протеиногенных аминокислот.

Задача 3.

После процедуры гидролиза β-эндорфина и последующей идентификации смеси аминокислот методом хроматографии установлен аминокислотный состав β-эндорфина: тир(1), гли (3), фен (3), мет, тре (3), сер (2), лиз(5), глн (2), про, лей (2), вал (2), асн (2), ала(2), илей, гис и глу.

Обработка карбоксипептидазой высвобождает глутамин, динитрофторбензолом − тирозин. После обработки трипсином в смеси обнаруживаются следующие пептиды и аминокислоты:

лиз, гли–глн, асп - ала - илей - вал, лиз,

тир - гли – гли - фен - мет – тре - сер – глу - лиз,

асн-ала-гис-лиз, сер-глн-тре-про-лей-вал-тре-лей,фен-лиз.

Обработка химотрипсином высвобождает:

лиз-асн-ала-илей-вал-лиз-асн-ала-гис-лиз-лиз-гли-глн,

тир-гли-гли-фен,

мет-тре-сер-глу-лиз-сер-глн-тре-про-лей-вал-тре-лей-фен.

Какова первичная структура β-эндорфина ?

Работа 1. Разделение смеси аминокислот методом восходящей хроматографии на бумаге.

Принцип метода. Распределительная хроматография основана на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях. Один из двух растворителей должен быть полярным (подвижная фаза), а другой – неполярным, (неподвижная фаза). Более гидрофобная аминокислота, лучше растворяющаяся в неполярном растворителе, движется с меньшей скоростью, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого аминокислоты по окончании хроматографического разделения оказываются на разном расстоянии от линии старта.

Методика. На конец полоски хроматографической бумаги нанести микропипеткой каплю смеси аминокислот (гистидина и лейцина). Каплю высушить. В пробирку налить 1-2 мл растворителя (смесь н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5), затем полоску хроматографической бумаги с нанесенной на нее смесью аминокислот опустить в пробирку до соприкосновения с растворителем и закрыть пробкой.

Через 1 час вынуть полоску бумаги, отметить уровень движения растворителя, просушить бумагу на воздухе. Смочить 0,5% раствором нингидрида в ацетоне, снова просушить на воздухе и поместить на 5-10 минут в термостат, при температуре 55-60o С. Отметить появление окрашенных пятен аминокислот – гистидина и лейцина. Рассчитать Rf для каждой аминокислоты.

Rf (коэффициент распределения) - отношение расстояния пройденного аминокислотой к расстоянию фронта растворителя.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]