Работа 2. Количественное определение альдолазы в сыворотке крови (метод Брунса в модификации е.Н. Валуйской и в.И. Товарницкого).

Активность веществ альдолазы в сыворотке крови составляет 3-13 единиц и выше. Активность альдолазы увеличивается при инфекционном гепатите, токсических поражениях печени и некоторых других заболеваниях.

Принцип метода. Альдолаза расщепляет фруктозо-1,6-дифосфат, продукты расщепления которого образуют с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде соединения, окрашенное в малиной цвет. Фруктозо-1,6-дифосфат инкубируется в буферном растворе с исследуемой пробой и гидразинсульфатом для связывания образующихся фосфотриоз. Белки осаждаются трихлоруксусной кислотой и в фильтрате фотометрически определяется окрашенное производное фосфотриоз. Интенсивность окраски пропорциональна активности альдолазы.

Ход работы. В центрифужную пробирку поместить 0,5 мл исследуемой сыворотки крови, 0,5 мл 0,5 % раствора NaHCO₃, 0,12 мл гидразинсульфата, 0,12 мл 0,002 М раствора монойодуксусной кислоты, 0,12 мл дистиллированной воды и 0,12 мл раствора фруктозо-1,6-дисфосфата. Смесь в пробирке перемешеть и поместить в термостат на 1 час при 38°С. После этого в пробирку добавить 1,5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и содержимое пробирки отцентрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость 0,5 мл перенести в чистую пробирку ,добавить в нее 0,5 мл 3 % раствора NаОН и оставить на 10 мин при комнатной температуре. После этого добавить 0,5 мл 0,1 % раствора 2,4-динитрофенилгидразина и поставить в термостат при 38°С. По истичении мин к содержимому пробирки добавить 3,5 мл 3% раствора NаОН и колориметрировать на ФЭКе в кювете толщиной 5 мм с зеленым светофильтром против воды.

Активность альдолазы сыворотки крови выражают в условных единицах экстинкции, умноженных на 100.

Работа 3. Определение активности альдолазы фруктозо-1-монофосфата.

Альдолаза фруктозо-1-монофосфата находится лишь в гепатоцитах, и обнаружение активности этого фермента в сыворотке крови является специфическим для поражений паренхимы печени.

Принцип метода основан на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментов фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелочном гидролизе продуктов динитрофенилгидразиновой реакции.

Ход работы. В пробирку внести 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл субстратного раствора (100 мл бариевой соли фруктозо-1-фосфата растворить в 180 мл дистиллированной воды, прибавить 82мл гидразин-гидрохлорида и довести рН до 7,4, добавляя 0,75н. NаОН, прилить веронал-мединаловой буфер рН 7,4 до конечного объема 400 мл).

В контрольную пробирку внести 1 мл сыворотки крови. Инкубировать в термостате контрольную и опытную пробу 30 мин при 37°С. После инкубации в контрольную пробирку добавить 0,5 мл субстратного раствора. Остальные реактивы приливать в обе пробирки одновременно. Для дефосфорилирования образовавшейся фосфотриозы прибавить по 1 мл 0,75 н NаОН и оставить при комнатной температуре на 30 мин. Добавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина 0,1 % раствора в 2 н НСI (500 мл 2,4-ДНФГ растворяют в 80 мл концентрированной НСI при слабом нагревании и доводят до 500 мл водой) и оставить на 30 мин. Затем добавляют по 3 мл 0,75Н NаОН и через 5 минут опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре против контроля.

Количество образовавшихся триоз определяют по стандартной кривой, построенной по диоксиацетону. Активность фермента рассчитывают по формуле А=а/Т, где А – активность фермента (мкмоль) в 1 мл сыворотки за 1 мин; а – количество образовавшихся триоз, рассчитанное по стандартной калибровочной кривой; Т – время инкубации (мин).