Работа 6. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназной активности.

Принцип метода основан на изменение окраски метиленовой сини при восстановлении его в ходе дегидрогеназной активности. При дегидрировании янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой акцептором водорода является метиленовая синь, которая при восстановлении обесцвечивается. Чем быстрее обесцвечивается метиленовая синь, тем выше активность сукцинатдегидрогеназы. Ингибирование фермента замедляет скорость обесцвечивания метиленовой сини.

Ход работы. В три пронумерованные пробирки поместить 3-4 капли мышечной кашицы и добавить: в первую – 0,8 мл воды, во вторую- 0,2 мл 1% раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, в третью – 0,8 мл 1% раствора малоновой кислоты. Во все три пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора янтарной кислоты и по 1 капле 1% раствора метиленовой сини. После перемешивания добавляют по 3 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 37⁰С. Через 5 мин наблюдают изменение окраски раствора. Сравнить степень уменьшения голубого окрашивания в 3-х пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – б; 1.2. –в; 1.3 –в;

2.1. 1-В; 2-А; 3-Б; 4-Г;

2.2. 1-б; 2-а; 3-а; 4-б; 5-в;

2.3. 1-А; 2-В; 3-Б; 4-Г; 5-Д;

3.1.- В (2,4) 3.2- А (1,2,3). 3.3- А(1,2,3);

4.1. Д (неверно, верно, неверно);

4.2. С (верно, неверно, неверно).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

График Лайнуивера-Берка – график двойных обратных величин ( против ).

Отрезок на горизонтальной оси =

Отрезок на вертикальной оси =

Тип ингибирования неконкурентный, т.к. в присутствии ингибитора Кm (т.е сродство фермента к субстрату ) не изменилось.

Задача 2.

Ответ. Число оборотов – количество молекул субстрата, превращаемого одной молекулой фермента за единицу времени.

9,6/60:10/50000=800сек^-1

Задача 3.

Ответ. 67210¹¹ г.

Задача 4.

Ответ. Отрезок на оси абсцисс =

Отрезок на оси ординат =

ммоль/л

ммоль/л

В присутствии ингибитора значение Кm не изменилось. Следовательно, тип ингибирования неконкурентный.

Контрольные вопросы по модулю «Ферменты»

1. Что такое фермент? История развития учения о ферментах. Борьба материалистических представителей о природе ферментов.

2. Сходства и отличия ферментов и неорганических катализаторов.

3. Общие свойства ферментов. Какие опыты позволяют их обнаружить.

4. Химическая природа ферментов. Ферменты-протеиды и ферменты-протеины. Что такое кофермент, апофермент, холофермент.

5. Коферменты и их химическая природа. В чем заключается связь между витаминами и ферментами?

6. Активный центр фермента, особенности его строение и роль. Что такое «якорная» (субстратная) площадка?

7. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры и рН, графическое изображение зависимости.

8. Константа Михаэлиса, ее вывод и физический смысл.

9. Зависимость ферментной реакции от концентрации субстрата. Уравнение Михаэлиса-Ментен. График зависимости. Анализ уравнения Михаэлиса-Ментена. (различные соотношения S м Км). Уравнение Лайнуивера-Берка его графическое выражение.

10. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента. График зависимости.

11. Активаторы ферментов, типы их действия.

12. Ингибиторы ферментов. Специфические и неспецифические, обратимое и необратимое, конкурентное и неконкурентное, ингибирование. Какой опыт иллюстрирует конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы.

13. Механизм действия ферментов. Влияние ферментов на энергию активации реакции. Механизм действия холинэстеразы.

14. Специфичность действия ферментов. Виды специфичности

15. Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика отдельных классов и подклассов ферментов. Цифровой шифр ферментов.

16. Единицы выражения активности ферментов.

17. Изоферменты. Значение определения изоферментов в медицинской практике. Изоферменты лактатдегидрогеназы.

18. Понятие о мультиферментных комплексах.

19. Что лежит в основе количественного определения ферментов? Принцип методов количественного определения амилазы и фосфатазы.

20. Энзимодиагностика различных заболеваний.

21. Понятие и примеры энзимопатий.

22. Понятие о энзимотерапии в медицинской практике. Примеры ферментных препаратов.

23. Иммобилизованные ферменты (ИФ). Понятие об инженерной энзимологии. Применение ИФ в промышленности.

24. Применение ИФ в фармации, аналитической химии и медицине.