Работа 2. Определение активности пепсина и уропепсина.

Принцип метода. Метод основан на способности пепсина в определенных условиях расщеплять белковую молекулу гемоглобина с освобождением тирозина и триптофана. По концентрации последних судят о пептической активности желудочного сока или мочи. Около 1 % пепсиногена, вырабатываемого клетками слизистой оболочкой желудка, поступает в кровь и выводится почками с мочой в виде уропепсиногена.

Ход определения. Определение уропепсина.

Из суточного количества мочи отбирают 20 мл, помещают в градуированный цилиндр, подкисляют раствором соляной кислоты до рН 1,5 и доводят дистиллированной водой до 25 мл. Таким же путем доводят раствор гемоглобина до рН 1,5. В пробирку отмеривают 1 мл подкисленной мочи, добавляют 5 мл раствора гемоглобина и выдерживают на водяной бане при 37° в течение 30 мин. Затем добавляют 10 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, фильтруют и в фильтрате определяют тирозин. Для этого к 2 мл фильтрата добавляют 5 мл дистиллированной воды, 8 мл раствора щелочи и 3 мл реактива Фолина, предварительно разведенного водой в 3 раза. После добавления последнего развивается голубая окраска. Через 30 мин, на фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность при длине волны 580 нм. Опыт сравнивают с контролем.

Расчет содержания пепсиногена в суточном количестве мочи производят по формуле:

П_сут. = 20хДхVхХ (Ед/24 часа),

.где Д — оптическая плотность исследуемой мочи; Х — количество тирозина в мг, которое определено по калибровочной кривой; V — объем мочи за 24 часа.

Определение пепсина в желудочном соке.

Производят аналогичным способом, с той лишь разницей, что для исследования берут 5 мл желудочного сока. Расчет производят на 100 мл желудочного сока.

Работа 3. Количественное определение активности уропепсина в моче по видоизмененному методу Веста.

В норме активность фермента составляет около 15—40 единиц. Определение содержания уропепсина имеет большое диагностическое значение, так как уровень выделения уропепсина отражает состояние секреторной функции желудка и изменяется параллельно с изменением кислотности желудочного сока. Увеличение активности уропепсина наблюдается при гиперацидном гастрите, язвенной болезни желудка; уменьшение — при гипоацидных гастритах, раке желудка, а также при заболеваниях желчных путей.

Принцип метода. Активированный в течение часа при 37°С соляной кислотой пепсиноген мочи (уропепсин) свертывает казеин молока. Активность уропепсина измеряется временем, необходимым для свертывания казеина. Мочу для исследования собирают за сутки или за определенный промежуток времени (2—3 часа).

Ход определения. В пробирку поместить 3, 8 мл мочи, прибавить 0,2 мл 2 н. раствора НС1 и 1—2 капли 0,2 % раствора метилоранжа. Пробирку поместить в термостат при температуре 37°С на 1 час. По истечении указанного времени в пробирку быстро прилить 0,5 мл молочно-ацетатной смеси. По секундомеру отметить время выпадения первых хлопьев.

Расчет. Активность уропепсина рассчитывается по формуле:

Х(Ед/час) = 10 × V

V_i × S × t

где V-весь объем мочи за данный промежуток времени; V_i-количество мочи, взятое для исследования; t-время, за которое была собрана вся моча; S-время свертывания молока.

Примерный расчет. В течение 3 часов (t=3) у больного было собрано 140 мл мочи (V=140). Для анализа было использовано 3,8 мл мочи (V_i=3,8). Первые хлопья казеина появились через 8 сек. После добавления молочно-ацетатной смеси (S=8). Активность уропепсина будет равна:

Х = 10 × 140 =15,3 Ед/час

3,8 × 8 × 3