Работа 3. Реакция на кетоновые тела (ацетон).

К кетоновым телам относятся ацетоуксусная кислота, -оксимасляная кислота и ацетон. Ацетоуксусная и -оксимасляная кислота являются продуктами неполного окисления жирных кислот. В крови в норме они содержатся в незначительных количествах (0,01-0,02 г/л), так как в тканях быстро окисляются до СО₂ и Н₂О.

Кетоновые тела появляются в моче (кетонурия) при увеличении их содержания в крови. В норме с мочой выделяется минимальное количество кетоновых тел (20-50 мг за сутки), которое не обнаруживается используемыми качественными пробами. Кетонурия появляется при сахарном диабете, голодании, гликогенозах и др.

При сахарном диабете печень бедна гликогеном, идет усиленный распад жиров как источника энергии. В результате -окисления накапливается ацетил-КоА, конденсация его приводит к образованию ацетоацетил-КоА, а в дальнейшем и ацетоуксусной кислоты.

Длительно продолжающиеся желудочно-кишечные заболевания у детей могут вызвать кетонемию в результате голода и истощения. Кетонемией сопровождаются углеводное голодание у детей, длительная физическая нагрузка.

Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашивание (проба Легаля).

СН₃-С-СН₃+Nа[Fе(СN)₅NO]+NaOHNa₄[Fе(СN)₅NO=CH-C-CH₃]+2H₂O.

 

O O

После подкисления пробы концентрированной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета:

Na₄[Fе(СN)₅NO=CH-C-CH₃]+CH₃COOHNa₃[Fе(СN)₅NO-CH₂-C-CH₃]+CH₃COONa

 

O O

Ход работы. На часовое стекло наливают 1 каплю мочи, 1 каплю 10% раствора едкого натра и 1 каплю свежеприготовленного нитропруссида натрия. Появляется оранжево-красное окрашивание. Добавляют 3 капли концентрированной уксусной кислоты - появляется вишневое окрашивание. Реакцию можно проводить в пробирке. Реакция неспецифична. Креатинин мочи дает аналогичное окрашивание с нитропруссидом, но при добавлении концентрированной уксусной кислоты жидкость не окрашивается в вишнёвый цвет.

Работа 4. Количественное определение суммарных липидов в сыворотке крови.

Принцип метода. Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом, состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина, соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови. Определение содержания липидов в сыворотке крови проводится для изучения состояния липидного обмена в организме. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови (нормолипемия) колеблется от 4,0-8,0 г/л. При физиологических условиях увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наблюдается через 1-4 часа после принятия богатой жирами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипемия). Гиперлипемия проявляется при многих патологических состояниях: у больных сахарным диабетом отмечается резко выраженная гиперлипемия (до 20,0 г/л), при заболеваниях почек (липоидном нефрозе), при поражении печени (циррозе печени и остром гепатите), при ожирении, при врожденной гиперлипемии, атеросклерозе и у лиц, злоупотреблении алкоголем.

Ход работы. В две пробирки (опытная и контрольная) наливают соответственно 0,1 мл сыворотки крови и 0,2 мл воды. В опытную пробирку вносят 2,9 мл, в контрольную 5,8 мл концентрированной серной кислоты (ОСТОРОЖНО!). Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 минут (при нагревании обращаться с пробирками осторожно). После нагревания обе пробирки вынимают и быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Затем отбирают из опытной – 0,2 мл, а из контрольной – 0,4 мл охлажденного раствора и переносят его в чистые пробирки, в которых предварительно налито в опытную пробирку 3 мл, а в контрольную пробирку – 6 мл фосфорнованилинового реактива (наслаивать осторожно). После тщательного перемешивания пробы оставляют на 45 мин. в темноте при комнатной температуре. После развития окраски оптическую плотность опытного раствора (А) против контроля измеряют на ФЭКе при длине волны в 530 нм светофильтр зеленый с кюветой 5мм.

Расчёт содержания общих липидов в сыворотке крови проводят по калибровочному графику по формуле:

Х(г/л)= А×10000×3

0,2×1000