Работа 2. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме.

Принцип метода. Метод основан на выявлении свободной формы ГИНК, которая с метаванадатом аммония в кислой среде дает комплексное соединение коричнево-красного цвета. Разница в окраске между пробами мочи до и после гидролиза указывает на степень ацетилированпя ГИНК в организме:

Ход определения. Собранную мочу разводят в 20 раз дистиллированной водой. В две пробирки вносят по 1 мл разведенной мочи; в одну из них (для определения общей ГИНК, т. е. суммы свободной и ацетилированной форм препарата) добавляют 1 мл раствора соляной кислоты, а во вторую (для выявления свободной ГИНК) — 1 мл дистиллированной воды.

Первую пробирку закрывают пробкой и ставят на 20 мин на кипящую водяную баню, после чего охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки приливают по 2 мл реактива метаванадата аммония и отмечают разницу в окрашивании исследуемых проб мочи.

Реакция N-ацетилирования ГИНК осуществляется специальной ацетилтрансферазой, содержащейся в различных тканях организма. В зависимости от активности этого фермента у разных людей их делят на быстрых и медленных «инактиваторов» (ацетиляторов) ГИНК, что имеет значение не только для практической фармакогенетики, но и для рациональной терапии. По степени ацетилирования ГИНК устанавливается эффективная индивидуальная доза препарата для конкретного больного.

Работа 3. Проба Квика—Пытеля.

Принцип метода. Проба основана на том, что ароматические соединения окисляются в организме до бензойной кислоты, которая в печени путем соединения с гликоколом переходит в гиппуровую кислоту. По количеству выделившейся гиппуровой кислоты после нагрузки бензойнокислым натрием судят о функции печени. Данную пробу применяют только в тех случаях, когда нет изменений функции почек.

При проведении пробы Квика на белых крысах животным подкожно в паховую область вводят 3 мл 5% -раствора бензойнокислого натрия в физиологическом растворе и 80,1 мг гликокола, растворенного в 3 мл 0,9% раствора хлористого натрия. Затем их помещают в обменные клетки на 18 часов; в течение которых собирают мочу.

В мочу крысы добавляют сернокислый аммоний (0,5 г на 1,0 мл), после растворения которого мочу отфильтровывают. На фильтре обычно остается осадок. В отфильтрованную мочу добавляют крепкую соляную кислоту (1-2 мл) до покраснения красной бумаги Конго. Пробу оставляют стоять для выпадения осадка не менее 2-х часов.

Для определения содержания гиппуровой кислоты титрованием осадок, промы­тый на фильтре до нейтральной реакции промывных вод, слегка подсушивают, чтобы его удобнее было снять с фильтра. Можно и сразу смыть из промывалки осадок с фильтра в химический стакан, на котором нанесена метка 100 мл. До этой метки наливают воду и доводят почти до кипения. Гиппуровая кислота при этом растворяется. Для титрования берут точно 10 мл и титруют 0,5 н. раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до розовой окраски.

Расчет. При определении количества гиппуровой кислоты методом титрования расчет количества выделившейся гиппуровой кислоты производят следующим образом. Например: объем мочи составляет 10 мл. На титрование 5 мл пошло 1,16 мл раствора NaOH: 1 мл 0,5 н раствора NaOH соответствует 0,0895 г гиппуровой кислоты, отсюда 1,16 мл х 0,0895= 0,104 г гиппуровой кислоты.

В норме у человека выделяется за сутки 2,8-3,0 г гиппуровой кислоты.