Качественная реакция на крахмал

К исследуемой жидкости добавить 1-2 капли раствора Люголя. При наличии крахмала отметьте появление темно-синего окрашивания.

Реакция Фелинга

К 10 каплям исследуемой жидкости прибавляют 10 капель реактива Фелинга и нагревают. В присутствии глюкозы и мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди. Полученный результат занести в табл. 10.

Таблица 10

№ п/п	Субстрат	Фермент	Температура	Реакция на крахмал с йодом	Реакция Фелинга	Выводы
1.
2.

Сделайте вывод о субстратной специфичности фермента.

Работа 3. Термолабильность ферментов.

Ферменты при нагревании до 60-80^о утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа снижается. В термолабильности ферментов можно убедится на примере действия ферментов слюны: амилазы и мальтозы.

Порядок выполнения работы

В чистую пробирку отливают небольшое количество разведенной слюны (2-3мл) и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают В 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В 1 пробирку добавляют 10 капель слюны, разведенной в 5 раз, во 2-ю 10 капель прокипяченной слюны, в 3-ю 10 капель воды (качестве контроля). Все пробирки помещают в термостат или водяную баню при температуре 38^она 10 минут. После этого проделывают качественные реакции на крахмал и реакцию Фелинга на продукты расщепления.

Реакция на крахмал. К 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калие. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание. Полученный результат занести в табл. 11.

Таблица 11

№ п/п	Субстрат	Фермент	Температура	Реакция на крахмал с йодом	Реакция Троммера	Выводы
1.
2.
3.

Работа 4. Влияние реакции среды (оптимум рН) на действие ферментов слюны.

Для проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются определенные условия, в том числе оптимальная концентрация водородных ионов. Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимум рН (см. табл. 12). Активность ферментов уменьшается, если рН меняется в любую сторону от оптимального значения. Отклонение рН от оптимума влияет на степень ионизации фермента и субстрата, может нарушить связь между белковой частью фермента и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментами.

Таблица 12

Оптимальное значение рН для некоторых ферментов

Фермент	рН
Пепсин	1,5-2,5
Трипсин	8,0-9,0
Сахараза кишечная	6,2
Амилаза слюны	6,9-7,0
Липаза желудочного сока	6,0
Липаза панкреатическая	7,0-8,5
Каталаза	7,0

Порядок выполнения работ

В 7 предварительно пронумерованных пробирок наливают 0,2 м раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 м раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице. Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по10 капель 1% раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 100 раз. Перемешивают содержимое пробирок и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38^о на 5-10 минут (в зависимости от индивидуальных особенностей активности слюны).

Таблица 13

Влияние рН среды на активность амилазы

№ п/п	Кол-во 0,2 м р-ра Na2HPO4 , мл	Кол-во р-ра лимонной к-ты, мл	рН смеси	Кол-во 0,5% р-ра крахмала на 1% р-р NaCl	Кол-во разведенной слюны(1:100), мл	Окрашивание с йодом
1.	0,58	0,42	5,6	по 10 капель	по 10 капель
2.	0,63	0,37	6,0
3.	0,69	0,31	6,4
4.	0,77	0,23	6,8
5.	0,87	0,13	7,2
6.	0,94	0,06	7,6
7.	0,97	0,03	8,0

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода в йодистом калие, перемешивают, наблюдают окраску и определяют рН, при котором амилаза действует наиболее активно. В зависимости от активности слюны ее можно разводить не в 100, а в 50 или 10 раз.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1.-в; 1.2 –б; 1.3. –а;

2.1.-В; 2-А; 3-Д; 4-Б; 5-Е; 6-Г;

2.2.-Г; 2-Б,В,Д; 3-Г; 4-Г; 5-Б; 6-Е; 7-Б.

3.1.Г (4). 2 - В (2,4). 3 - Д (все перечисленное).

4.1. Д (неверно, верно, связи нет)

4.2. Д (неверно, верно, связи нет).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Ответ. Как и большинство протеолитических ферментов, трипсин обладает специфичностью действия - этот фермент активен в отношении пептидных связей, образованных карбоксильной группой аргинина и лизина. Молекулы трипсина не атакуют друг друга, т.к. аминокислотные последовательности на поверхности молекулы трипсина не соответствуют его специфичности.

Задача 2.

Ответ. Согласно теории индуцированного соответствия (теории Кошленда), связываясь с активным центром, субстрат вызывает изменение пространственной формы молекулы фермента и переводит его в более устойчивую, стабильную конформацию.

Задача 3.

Ответ. Наличие сильного положительного заряда, большое число свободных орбиталей (следовательно, способность связывать большое число лигандов), возможность выступать в роли как акцептора, так и донора электронов – все эти свойства переходных металлов обусловливают их участие в биокатализе в качестве кофакторов.

Занятие 7. Количественное определение активности ферментов.

Модификаторы активности ферментов.

Зачетное занятие по модулю «Ферменты».

Цель занятия. В результате освоения темы занятия студент должен уметь проводить количественное определение активности амилазы слюны; доказывать и объяснять изменения ее активности под влиянием ионов; определять активность лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и их изоферментов; интерпретировать полученные результаты. Для приобретения умения и навыков студент должен усвоить теоретический материал модуля «Ферменты».

Содержание занятия. На данном занятии студентам предстоит ответить на тесты программированного контроля и вопросы преподавателя, принять участие в групповой конференции по теме занятия. Лабораторный практикум включает определение активности амилазы слюны и исследование влияния различных модификаторов на ее активность, определение активности щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и ее изоферментов в сыворотке крови, а также изучение действия малоната на активность сукцинатдегидрогеназы.

В заключении студенты выполняют письменную зачетную работу по модулю «Ферменты».

УИРС. Темы реферативных сообщений:

1. Энзимодиагностика в современной медицине. Изоферменты.

2. Иммобилизованные ферменты.

3. Иммуноферментный анализ.