- •Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет
- •Руководство
- •060108 - Фармация
- •Оглавление
- •Введение
- •Правила работы с тестами
- •Модуль 1. Строение и функции белков. Биологические мембраны. Занятие 1. Введение в биохимический практикум. Методы качественного и количественного анализа белков.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний Задание 1. Выберите один наиболее правильный ответ:
- •1.2. Какие аминокислоты придают белкам основный характер?
- •3.1. Какие агенты позволяют определить n-концевую аминокислоту?
- •3.2. Какие агенты позволяют определить с-концевую аминокислоту?
- •3.3. Какие аминокислоты появляются в белках только в результате постсинтетической модификации?
- •4.1. При установлении аминокислотной последовательности проводится кислотный, а не основный гидролиз белка, так как в щелочной среде происходит разрушение некоторых аминокислот.
- •5.1. Установите последовательность операций при определении первичной структуры белка.
- •Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Работа 1. Разделение смеси аминокислот методом восходящей хроматографии на бумаге.
- •Работа 2. Количественное определение белка сыворотки крови биуретовым методом.
- •Фотоэлектроколориметр
- •Эталоны ответов к тестовым заданиям
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Методические указания к подготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •2.2. Уровень организации белковой молекулы – ее структурный элемент.
- •4.1. Сернокислый аммоний вызывает денатурацию белка, потому что сернокислый аммоний обладает водоотнимающим действием с одновременной нейтрализацией электрического заряда.
- •4.2. Белки наиболее подвижны в электрическом поле в изоэлектрическом состоянии, потому что при этом белки имеют положительный заряд.
- •Работа 2. Осаждение белков при кипячении.
- •Работа 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
- •Осаждение белков медным купоросом.
- •Осаждение белков уксуснокислым свинцом.
- •Работа 4. Осаждение белков органическими кислотами.
- •Работа 5. Осаждение белков концентрированной азотной кислотой (проба Геллера).
- •Работа 6. Количественное определение белка в моче по методу Робертса-Стольникова-Брандберга.
- •Эталоны ответов к тестовым заданиям
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 3. Методы выделения и очистки белков.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •3.2. Какой метод разделения белков основан на различии размера белковых молекул?
- •3.3. Какие из электрофоретических процедур не зависят от заряда белка?
- •4.1. Очистить раствор белка от низкомолекулярных примесей можно методом гель-фильтрации на сефадексе, потому что с помощью этого метода можно разделить вещества с разной молекулярной массой.
- •4.2. По степени дисперсности растворы белков являются истинными растворами, а по свойствам – коллоидными, так как белки являются высокомолекулярными соединениями.
- •Порядок выполнения работы
- •Работа 2. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле.
- •Работа 3. Очистка белков от низкомолекулярных примесей методом диализа.
- •Работа 4. Очистка от низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе (молселекте).
- •Эталоны ответов к тестовым заданиям
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1.1. Как связывается гемоглобин с углекислым газом?
- •1.2. Какие гормоны по структуре являются гликопротеинами?
- •1.3. Избирательная проницаемость мембран достигается путем активного транспорта. Активный транспорт отличается от пассивного тем, что
- •3.1. Во многих гликопротеинах углеводный компонент соединяется к белку посредством гликозидной связи через
- •3.2. Протеогликановые комплексы (мукополисахариды) характеризуются
- •4.2. ТРнк участвует в синтезе белка, потому что она транспортирует иРнк.
- •Работа 2. Выделение муцина слюны и определение в нем углеводного компонента.
- •Работа 3. Выделение казеина из молока.
- •Работа 4. Определение липопротеинов низкой плотности (лпнп) в сыворотке крови турбидиметрическим методом.
- •Занятие 5. Зачетное занятие по модулю «Строение и функции белков. Биологические мембраны.»
- •Методические указания к самоподготовке
- •Контрольные вопросы по модулю «Строение и функции белков. Биологические мембраны.»
- •Модуль 2. Ферменты. Занятие 6. Общие свойства ферментов.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов для контроля исходного уровня знаний
- •3.1. Укажите, что отличает фермент от неорганического катализатора.
- •3.2.Для количественного определения глюкозы в сыворотке крови применяют ферменты:
- •3.3. Влияние рН на ход реакции, катализируемой ферментом, заключается в том, что
- •4.2. По химической структуре все ферменты без исключения являются белками, потому что рибозимы – класс биокатализаторов, являющихся по структуре рнк.
- •Работа 2. Специфичность ферментов.
- •Качественная реакция на крахмал
- •Реакция Фелинга
- •Работа 3. Термолабильность ферментов.
- •Порядок выполнения работы
- •Работа 4. Влияние реакции среды (оптимум рН) на действие ферментов слюны.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •2.2. Определите тип ингибирования
- •2.3. Типы ингибирования ферментов – определение понятия:
- •3.1. Лекарственные вещества-антиметаболиты являются
- •3.2. Как в фармации используются иммобилизованные ферменты?
- •3.3. В чем преимущества ферментного анализа перед химическим в фармпроизводстве?
- •4.1 При действии фосфакола уменьшается количество ацетилхолина в синаптической щели, потому что происходит фосфорилирование фосфаколом он –группы серина в активном центре холинэстеразы.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Методы количественного определения активности
- •Работа 3. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле (по Дитцу и Лубрано).
- •Работа 4. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу n-нитрофенилфосфата.
- •Работа 5. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.
- •Работа 6. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназной активности.
- •Модуль 3. Витамины. Биоэнергетика гетеротрофных и фотосинтезирующих организмов. Занятие 8. Витамины - незаменимые компоненты пищи. Качественные реакции на витамины.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •2.2. Сопоставьте химическое название витамина и название по проявлению недостаточности
- •3.1. Метаболизм витамина д заключается
- •3.2. Какие утверждения относительно витамина а являются верными?
- •3.3. Какие антивитамины используются с лечебной целью?
- •4.1. Витамин к участвует в постсинтетической модификации белков свертывания крови, потому что служит коферментом карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты в составе этих белков.
- •4.2. Красномякотные овощи и фрукты богаты каротинами, потому что каротины являются провитаминами е.
- •4.3. При недостатке холина наблюдается накопление в печени нейтральных липидов, поскольку холин необходим для синтеза фосфолипидов. Примеры ситуационных задач
- •Работа 7. Качественная реакция на витамин в6.
- •Работа 8. Определение тиамина в поливитаминных препаратах.
- •Работа 9. Определение рибофлавина в поливитаминных препаратах.
- •Эталоны ответов к тестовым заданиям
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 9. Коферментные формы витаминов и их роль в процессах метаболизма.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1.1. Какой витамин наиболее токсичен при гипервитаминозе?
- •1.2. Какое утверждение относительно витамина в12 является верным?
- •2.2. Витамин – антивитамин.
- •. Витамин-проявление недостаточности или авитаминоза.
- •2.4. Кофермент – класс фермента
- •3.1.Кофермент витамина в6 пиридоксальфосфат участвует
- •3.2. Какие утверждения относительно пернециозной анемии являются верными?
- •4.1.Отсутствие в пище незаменимой аминокислоты триптофан способствует развитию гиповитаминоза рр, потому что небольшая часть витамина рр в организме синтезируется из триптофана.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Самостоятельная работа студентов
- •Работа 1. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях по Тильмансу.
- •Работа 2. Количественное определение витамина р в чае по Левенталю.
- •Эталоны ответов к тестовым заданиям
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 10. Энергетический обмен. Ферменты биологического окисления. Общие пути катаболизма.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний Задание 1. Выберите один наиболее правильный ответ.
- •3.1. Какие коферменты входят в состав пируватдегидрогеназного комплекса?
- •3.2. Примерами субстратного фосфорилирования являются реакции
- •3.3. Какие из перечисленных условий уменьшают скорость окисления ацетата в цтк?
- •4.1 В ходе цикла лимонной кислоты происходит окислительное декарбоксилирование пирувата, потому что цтк протекает в матриксе митохондрий.
- •Работа 2. Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц.
- •Работа 3. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а. Н. Бояркина.
- •Работа 4. Восстановление цитохрома с.
- •Работа 5. Обнаружение активности цитохромоксидазы.
- •Задача 3.
- •Занятие 11. Тканевое дыхание. Окислительное фосфорилирование. Свободное окисление – микросомальное, пероксисомальное (семинар).
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестовых заданий Задание 1. Выберите один наиболее верный ответ.
- •Задание 2. Установите соответствие.
- •2.2 Тип реакции – уравнение реакции
- •2.3. Фермент – катализируемая реакция
- •3.2. Какие из перечисленных соединений обладают разобщающим действием?
- •Задача 2.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 12. Фотосинтез. Качественные реакции на пигменты растений.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов для контроля исходного уровня знаний
- •5. Переносчиками электронов в фс1 при нециклическом транспорте являются:
- •6. Указать процесс, который не относится к реакции световой фазы:
- •7. Компонентов акцепторной системы реакционного центра фс1:
- •8. Циклического потока электронов в фс1:
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Качественные реакции на пигменты растений.
- •Модуль 4. Обмен и функции углеводов. Занятие 14. Обмен углеводов. Сахар крови. Регуляция сахара крови.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •2. 2. Установить соответствие:
- •Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 3.
- •Самостоятельная работа студентов
- •Глюкозооксидазным методом.
- •Работа 2. Определение глюкозы в крови по цветной реакции с орто-толуидином.
- •Работа 3. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче.
- •Работа 4. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.
- •Работа 5. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови.
- •Эталоны ответов к тестам
- •Эталоны ответов к ситуационным задачам Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 15. Тканевый обмен углеводов. Регуляция обмена углеводов. (Семинар).
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 16. Зачётное занятие по модулю «Обмен и функции углеводов».
- •Методические указания к самоподготовке
- •Контрольные вопросы
- •Модуль 5. Обмен и функция липидов. Занятие 18. Обмен триацилглицеринов.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1.1. К какому классу относятся ферменты, участвующие в расщеплении жиров в желудочно-кишечном тракте?
- •1.2. Высшие жирные кислоты образуются из всех перечисленных соединений, кроме:
- •Установить соответствие:
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Количественное определение активности липазы в панкреатическом соке.
- •Работа 2. Количественное определение триацилглицеринов в сыворотке крови.
- •Работа 3. Реакция на кетоновые тела (ацетон).
- •Работа 4. Количественное определение суммарных липидов в сыворотке крови.
- •Эталоны ответов к тестам
- •Эталоны ответов к ситуационным задачам
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Занятие 19. Обмен холестерина и фосфоглицеридов. Регуляция обмена липидов. Нарушения обмена липидов.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1.1. Донором метильных групп для синтеза фосфатидилхолина из фосфатидилэтанол-амина является:
- •1.2. В результате какой реакции образуется фосфатидная кислота:
- •2.1. Установить соответствие:
- •2.4. Установить соответствие:
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Количественное определение содержания лецитина в сыворотке крови.
- •Работа 2. Количественное определение холестерина в сыворотке крови по методу Илька.
- •Эталоны ответов к тестам
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Контрольные вопросы
- •Модуль 6. Обмен аминокислот и белков. Занятие 21. Переваривание и всасывание белков. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1.1 Трипсин гидролизует пептидные связи, образованные:
- •1.2. Пепсин – фермент, относящийся к классу:
- •2.1. Установить соответствие:
- •Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Проба на сычужное действие пепсина.
- •Работа 2. Определение активности пепсина и уропепсина.
- •Работа 3. Количественное определение активности уропепсина в моче по видоизмененному методу Веста.
- •Работа 4. Количественное определение протеолитической активности желудочного сока по Ансону.
- •Эталоны ответов на тесты
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 22. Обмен и функции аминокислот.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1.1. Какой витамин входит в состав коферментов аминотрансфераз?
- •3.1. Какие метаболиты образуются при катаболизме указанных аминокислот?
- •3.2. Установите соответствие:
- •Незаменимые аминокислоты могут синтезироваться в организме, потому что их синтезирует флора кишечника.
- •При шизофрении нарушен обмен серотонина, потому что снижена активность дофа-декарбоксилазы. Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Колориметрический метод определения активности аспартат- и аланин-аминотрансфераз в сыворотке крови.
- •Работа 2. Количественное определение остаточного азота в крови
- •Работа 3. Количественное определение мочевины в моче по Рашковану.
- •Работа 4. Определение содержания мочевины в сыворотке крови ферментативным методом.
- •Эталоны ответов на тесты
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 23. Матричные синтезы: биосинтез нуклеиновых кислот и белка. (Семинар).
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •1. Как соединяются между собой нуклеотиды?
- •2. Укажите название фермента, катализирующего синтез рнк-затравки:
- •Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 24. Обмен нуклеопротеинов и нуклеотидов. Количественное определение мочевой кислоты в сыворотке крови.
- •Методические указания
- •Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови фосфорновольфрамовым методом.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Эталоны ответов ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 25. Обмен хромопротеинов.
- •План занятия
- •Методические указания для самоподготовки
- •1. Превращение биливердина в билирубин катализирует фермент:
- •2. Обезвреживание билирубина в печени происходит при участии фермента:
- •3. Установить соответствие:
- •Самостоятельная работа студентов
- •По методу Йендрашека.
- •Работа 2. Проба на желчные пигменты в моче с реактивом Фуше.
- •Работа 5. Проба Флоренкса на уробилин (стеркобилин) в моче.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Эталоны ответов к ситуационным задачам Задача 1.
- •Занятие 26. Зачётное занятие по модулю «Обмен белков и аминокислот».
- •Методические указания к самоподготовке
- •Контрольные вопросы к коллоквиуму
- •Модуль 7. Интеграция и регуляция обмена веществ. Гормоны. Занятие 27. Взаимосвязь обмена веществ и его регуляция. Гормоны белковой природы. Качественные реакции на гормоны.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры ситуационных задач
- •Работа 4. Количественное определение адреналина в биологических жидкостях.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Эталоны ответов ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 28. Стероидные гормоны. Тканевые гормоны. Простагландины.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний.
- •Примеры ситуационных задач
- •Работа 2. Качественное определение 17-кетостерондов в моче.
- •Работа 3. Количественное определение 17-кетостероидов в моче.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Эталоны ответов ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 29. Зачетное занятие по модулю «Интеграция и регуляция обмена веществ. Гормоны».
- •Методические указания к самоподготовке
- •Контрольные вопросы к коллоквиуму
- •Модуль 8. Функциональная биохимия специализированных тканей и органов. Занятие 30. Биохимия крови.
- •Методические указания для самоподготовки
- •Примеры ситуационных задач Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний.
- •Выберите наиболее часто встречающиеся причины возникновения железодефицитных анемий:
- •Какие ферменты участвуют в реакциях инактивации активных форм кислорода?
- •Креатинкиназа сыворотки крови относится к секреторным ферментам крови, потому что креатинкиназа секретируется в кровь из печени.
- •Самостоятельная работа студентов
- •Работа 1. Определение содержания гемоглобина в крови
- •Цианметгемоглобиновым методом.
- •Работа 2. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом.
- •Работа 3. Определение щелочного резерва крови титриметрическим методом.
- •Работа 4. Метод определения кальция по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина.
- •Работа 5. Определение времени свертывания крови (метод Мас и Магро).
- •Работа 6. Определение времени рекальцификации плазмы.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Эталоны тветов ситуационных задач
- •Задача 3.
- •Занятие 31. Биохимия специалированных тканей и органов.
- •Методические указания для самоподготовки
- •Примеры тестов контроля усвоения исходного уровня знаний
- •1. При какой желтухе возрастает содержание в крови прямого билирубина и активность алт?
- •2. Выберите процессы, обеспечивающие энергией интенсивно работающую мышцу.
- •4. Установить соответствие:
- •5. Какие процессы лежат в основе детоксикации ядовитых веществ в печени?
- •6. Какие из перечисленных процессов происходят только в печени?
- •Ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Самостоятельная работа студентов
- •Работа 1. Пробы коллоидоустойчивости.
- •Работа 2. Количественное определение альдолазы в сыворотке крови (метод Брунса в модификации е.Н. Валуйской и в.И. Товарницкого).
- •Работа 3. Определение активности альдолазы фруктозо-1-монофосфата.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.
- •Задача 2.
- •Занятие 32. Биохимия почек.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов контроля исходного уровня знаний
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Определение показателей физико-химических свойств мочи.
- •Работа 2. Определение химических компонентов нормальной мочи.
- •Работа 3. Патологические компоненты мочи.
- •1. Качественное определение белка.
- •2. Качественное определение сахара в моче с помощью реактива Фелинга.
- •3. Качественное обнаружение сахара в моче при помощи индикаторной бумаги «Глюкотест».
- •4. Количественное определение белка в моче по методу Робертса-Стольникова.
- •5. Качественное определение кетоновых тел.
- •6. Качественная реакция на кровяные пигменты.
- •7. Качественное определение желчных пигментов.
- •8. Проба Петенкофера на желчные кислоты.
- •9. Проба Яффе - реакция на уробилин.
- •10. Качественное определение индикана в моче.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов для контроля исходного уровня знаний
- •1. Липотропные фармакопрепараты метаболизируются преимущественно с участием ферментов:
- •2. Первая фаза биотрансформации включает все перечисленные реакции,
- •3. Установить соответствие:
- •4. Установить локализацию реакции биотрансформации:
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1.Определение активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой.
- •Работа 2. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови.
- •Эталоны ответы на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Занятие 34. Биотрансформация лекарственных веществ. Реакции второй фазы биотрансформации.
- •Методические указания к самоподготовке
- •Примеры тестов для контроля исходного уровня знаний
- •Самостоятельная работа студентов Работа 1. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов.
- •Работа 2. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме.
- •Работа 3. Проба Квика—Пытеля.
- •Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
- •Занятие 35. Зачетное занятие по модулю «Фармацевтическая биохимия».
- •Методические указания к самоподготовке
- •Контрольные вопросы
- •Приложения
- •Рекомендуемая литература
- •Журналы по биохимии
- •Некоторые биохимические показатели жидких сред организма
- •Вопросы к зачету по биохимии для 2 курса фармацевтического факультета
- •Контрольные вопросы к коллоквиуму «Функциональная биохимия»
Работа 3. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле (по Дитцу и Лубрано).
Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.
Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.
Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов №1, №2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.
Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги.
Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0,1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки.
Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером.
Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний - к катоду. В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4мА. Длительность электрофореза около 90 мин.
Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС- по 2,5 мл и ФМС – 0,25 мл, перемешивают содержимое колбочки.
По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки.
Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющуюся жидкость. Пробирки ставят в термостат при 370 С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля.
По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте.
Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-850С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида.
Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке.
Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:
, где Е- экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящейся к данному изоферменту; ∑ Е- сумма экстинкций всех изоферментов; А- активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л).
Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления.
Практическое значение работы. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментого спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом тканей и органов. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ1 и ЛДГ2 (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ3, а в скелетной мышце и печени-ЛДГ4 и ЛДГ5 (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ1-31, ЛДГ2-47, ЛДГ3-12, ЛДГ4-5, ЛДГ5- 4. При инфаркте миокарда увеличивается доля ЛДГ1 и ЛДГ2 (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.
При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ4 и ЛДГ5. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.
При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ3 в сыворотке крови.