Работа 4. Восстановление цитохрома с.

Цитохромы участвуют в митохондриальной дыхательной цепи в качестве переносчиков электронов от флавопротеидов к кислороду. Кислород активируется и соединяется с ранее ионизированными атомами водорода, образуя воду. При восстановлении красный раствор цитохрома С бледнеет.

Ход работы. В пробирку прилить 0,001% раствор цитохрома С. В другую пробирку с газоотводнойтрубкой налить немного соляной кислоты и бросить кусочек металлического цинка. Закрыть пробирку пробкой с газоотводной трубкой и пропускать пузырьки выделяющегося водорода через раствор цитохрома С. Через некоторое время отметить изменение интенсивности окраски раствора фермента.

Работа 5. Обнаружение активности цитохромоксидазы.

При добавлении к срезам тканей α-нафтола и парафенилендиамина происходит окрашивание тканей вследствие образования индофеноловой сини. Эта реакция катализируется цитохромоксидазой.

Ход работы. На часовое стекло взять срез свежей ткани, например печени или мышцы, на него нанести по 1 капле 1% спиртового раствора α-нафтола и 1% водного раствора парафенилендиамина. Появление синего окрашивания на срезе ткани указывает на присутствии в ней активной цитохромоксидазы.

Химизм реакции:

	О2 цитохромоксидаза
α – нафтол n-дифениламин		индофеноловая синь

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1.- а, 2- В, 3- Г;

2.1. 1-в, 2-а, 3-б, 4-г, 5-в;

2.2. 1-г, 2-в, 3-а, 4-б;

2.3. 1-А; 2-В; 3-Д; 4-Б4 5-Г; 6-А;

3.1. А (1,2,3);

3.2. Б (1, 3);

3.3. Г (4);

4.1. D (-+-);

4.2. С(+--).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Ответ. Энергия гидролиза АТФ составляет –7,3 ккал/моль, следовательно, гидролиз 12,5 молекул АТФ высвобождает 12,57,3 =91,3 ккал/моль энергии, тогда как образование этого количества АТФ требует 273 ккал. Эффективность составляет 91,3100/273=33,4%.

Задача 2.

Ответ. В результате альдольной конденсации щавелевоуксусной кислоты и меченого по указанным положениям ацетила образуется лимонная кислота со следующим распределением радиоактивной метки

Углеродные атомы, имеющие происхождение из меченого ацетила, в ходе первого оборота цикла окисляться не будут, поэтому радиоактивная метка будет обнаруживаться в центральных атомах регенерированного ЩУК (НООС-¹⁴СН₂¹⁴СО-СООН). В ходе второго оборота, после конденсации ацетила и меченого ЩУК, будет образовываться лимонная кислота:

поэтому, в ходе второго оборота меченые углероды окислительному декарбоксилированию подвергаться не будут и выделится ЩУК со следующим распределением радиоактивной метки НООС-СН₂¹⁴СО-¹⁴СООН. Таким образом, ¹⁴СО₂ будет выделяться в ходе третьего оборота цикла.

Задача 3.

Ответ. Активность ферментов определяется при концентрациях субстрата, обеспечивающих V max, поэтому состав инкубационной среды по прямой реакции должен содержать субстрат – яблочную кислоту. Достижение V max требует и поддержания оптимального значения рН, следовательно, должен использоваться соответствующий буфер. Вследствие того, что НАД-зависимые дегидрогеназы непрочно связывают кофермент, требуется добавление к среде определения и кофермента – окисленной формы НАД. Для определения активности фермента по обратной реакции (по убыванию светопоглощения) среда будет содержать оксалоацетат, восстанновленный НАД и соответствующий буфер.