Работа 4. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу n-нитрофенилфосфата.

Фосфатазы – ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты органических эфирных соединений. В зависимости от рН, при котором проявляется их наибольшая ферментативная активность, различают «кислую» и «щелочную» фосфатазы. Термином «щелочная фосфатаза» обозначается целый ряд ферментов с оптимумом активности при рН от 8,6 до 10,1, сильным активатором этих ферментом является ионы магния.

Щелочная фосфатаза практически содержится во всех тканях человека. Особенно много ее обнаруживается в костной ткани, паренхиме печени, почек, предстательной железы, молочной железы и в клетках слизистой кишечника. Значительная часть фермента поступает из печени с желчью в кишечник.

Принцип метода. Субстрат - п- нитрофенилфосфат натрия гидролизуется ферментом сыворотки с образованием п-нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.

Ход работы. В опытную и контрольную пробирку вносят по 1 мл субстратно–буферного раствора, прогревают при 37⁰С в течении 5 мин. Затем в опытную пробирку добавляют 0,1 мл сыворотки крови, перемешивают и инкубируют обе пробирки в течении 30 мин в термостате при 37⁰С.

После инкубации пробирки охлаждают под струей холодной (!) воды и в контрольную пробу добавляют 0,1 мл сыворотки крови. Затем в обе пробирки интенсивной струей вносят по 10 мл 0,02 н раствора щелочи. Через 5 мин содержимое опытной пробы колориметрируют против контрольной пробы на ФЭКе при длине волны 400-420 нм (синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Расчет: находят разность экстинкций опытной и контрольной проб и по калибровочной кривой получают результаты, выраженные в мкмоль п- нитрофенола, образованного из натриевой соли п-нитрофенилфосфата под действием содержащейся в 0,1 мл сыворотки крови щелочной фосфатазы.

Активность фермента выражают в мкмоль/час на 1 мл сыворотки или в мкмоль-сек. На литр сыворотки крови. Для этого данные, полученные по калибровочному графику, умножают на 20 или 5,57 соответственно.

В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови составляет 1-3 мкмоль/час на 1 мл или 0,278-0,834 мкмоль/сек на литр.

Повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови обнаруживается при заболеваниях костной системы (рахит, гиперпаратиреодизм, злокачественные опухоли костей и др.) и печени (механической или обтурационной желтухе, вирусном гепатите, желтой атрофии печени). Уменьшение активности фермента в крови наблюдается при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.

Работа 5. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Целью данной работы является установление усиливающего и ингибирующего влияния различных ионов на каталитическую активность ферментов. Так, например, ионы натрия и хлора стимулируют активность амилазы слюны, а ионы меди, наоборот, тормозят ее.

Ход работы. В три пробирки налить по 10 мл разведенной в 10 раз слюны. В первую пробирку добавить 1 мл 1% раствора NaCl, во вторую-1 мл 1% раствора CuSО₄, в третью- 1 мл дистиллированной воды (контроль). После этого в каждую пробирку прилить по 4 мл 0,5% раствора крахмала, пробирки встряхнуть и поместить в водяную баню или в термостат с температурой 38⁰С на 10 мин. После истечения указанного времени с содержимым каждой пробирки проделать качественную реакцию на крахмал и пробу Троммера.

Полученные результаты занести в табл. 17.

Таблица 17

№ п/п

Субстрат

Фермент

Добавляемое вещество

Проба на крахмал

Проба Троммера

Вывод