Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
praktikum-po-bx-versiya-3.doc
Скачиваний:
7
Добавлен:
07.05.2019
Размер:
5.91 Mб
Скачать

Работа 2. Определение глюкозы в крови по цветной реакции с орто-толуидином.

Принцип метода. Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом.

Глюкоза при нагревании с о-толуидином в кислой среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови и определяется колориметрически на ФЭКе.

Ход определения. В центрифужную пробирку налить 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдуть на стенку пробирки 0,1 мл крови, взятой из пальца. Содержимое пробирки взболтать и центрифугировать 5-7 мин. при 1500 об/мин.

Взять две пробирки. В первую (опыт) прилить 0,5 мл центрифугата, во вторую (контроль) - 0,5 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и в обе пробирки добавить по 4,5 мл о-толуидинового реактива. Пробирки поместить на 8 мин. (точно!) в кипящую водяную баню и сразу охладить под водопроводной водой до комнатной температуры.

Опытную пробу колориметрировать против контроля или дистиллированной воды на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при красном (600-650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.

Расчет произвести по калибровочному графику или с применением стандартного раствора глюкозы.

Стандартная проба. Стандартную пробу проводят как опытную, но вместо крови используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 мМ (1,0 г/л), а в случае высокого содержания сахара в крови 16,65 мМ (3,0 г/л) или 27,75 мМ (5,0 г/л).

Расчет произвести по формуле:

Соп:= (Ссг х Еоп) / Ест = мМоль глюкозы или г/л глюкозы, где

Соп - концентрация глюкозы в опытной пробе,

Сст - концентрация глюкозы в стандартной пробе в мМ или г/л,

Еоп - оптическая плотность опытной пробы,

Ест - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

В норме содержание глюкозы в крови составляет 3,33-5,55 мМоль или 0,6-1,0 г/л. Гипергликемия наблюдается после приема пищи, содержащей большое количество сахара (алиментарная гипергликемия), а также при клинически выраженной форме сахарного диабета. Гипогликемия наблюдается после инъекций инсулина и при некоторых формах гликогенозов.

Работа 3. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче.

Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.

Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности (табл.26):

Таблица 26

Компоненты

Пробы крови, мл

Пробы мочи, мл

опытная

контрольная

опытная

контрольная

Суспензия субстрата

1

1

1

1

Инкубация в течение 5 мин. при + 37оС

Сыворотка крови

0,10

-

-

-

Моча

-

-

0,05

-

Дистиллированная вода

-

0,10

-

0,05

Инкубация в течение 15 мин. при + 37оС

Осаждающий раствор

2

2

2

2

Активность амилазы

Норма:

130-150 Е/л

Норма

1,00-2,00 Е/мл

Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.

Активность фермента находят по калибровочному графику.

У человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.

У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче - от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]