Изучение внутри и внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов

Котлованова О.В. (5 курс, леч. ф-т), Вереин К.В. (5 курс, леч. ф-т)

ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава

Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики

Научный руководитель – к.м.н., доц. Савочкина А.Ю.

Актуальность. Нейтрофилы играют очень важную роль в антимикробных реакциях врожденного иммунитета. Изначально считалось, что основной функцией нейтрофильных гранулоцитов является фагоцитоз. V. Brinkmann и соавт. в 2004 г. открыли способность нейтрофилов образовывать нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ).

Цель исследования: провести сравнительный анализ внутри и внеклеточного захвата и киллинга Candidaalbicans (штамм 601) нейтрофилами.

Материалы: чистая фракция нейтрофилов, выделенная из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, активатор - взвесь Candidaalbicans (шт. 601).

Методы. Инкубацию проводили при температуре 37°С в течение 30 минут. Клеточную взвесь окрашивали сложным красителем (синька Эванса и SytoxGreen). Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа. При подсчете препаратов оценивали активность фагоцитоза (процент активных фагоцитов среди нейтрофилов с сегментированным ядром), активность нейтрофильных внеклеточных ловушек (процент НВЛ, содержащих микроорганизмы). Показатели были рассчитаны на 100 нейтрофилов с сегментированным ядром и 100 НВЛ.Для оценки эффективности внутри- и внеклеточного уничтожения грибов Candidaalbicans нейтрофильными гранулоцитами определялось количество и жизнеспособность микроорганизмов захваченных НВЛ и нейтрофилом с неизмененной морфологией. С этой целью рассчитывались следующие показатели: фагоцитарное число (среднее количество микроорганизмов, захваченных активным нейтрофилом с сегментированным ядром), индекс НВЛ (среднее количество микроорганизмов, захваченных активной НВЛ).

Результаты.Установлено, что активность НВЛ достоверно выше активности фагоцитоза (61,50 ±1,36% и 46,25 ± 0,96%). Однако уровень НВЛ в перерасчете на общее количество нейтрофильных гранулоцитов был меньше чем количество нейтрофилов с сегментированным ядром (52,08 ± 1,25 % и 29,83 ± 1,54 %, соответственно). Поэтому был произведён перерасчет этих показателей, в соответствии с процентным содержанием клеток с сегментированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек на 100 % всех морфологических форм. Активность фагоцитоза составила 23,9 ± 0,79%; активность нейтрофильной внеклеточной ловушки 18,4 ±1,25%. На основании полученных данных установлено, что в целом количество нейтрофильных внеклеточных ловушек, осуществивших захват С. albicans, ниже количества активных фагоцитов. Фагоцитарное число нейтрофилов=2,55 ± 0,28 у.е.; индекс НВЛ=8,05 ± 0,69 у.е.Полученные данные свидетельствуют о том, среднее количество микроорганизмов попавших в нейтрофильную внеклеточную ловушку значительно превышает количество микробов, захваченных активным нейтрофилом с неизмененной морфологией. Но важно оценить не только поглощение микроорганизмов, но и их киллинг, как в активном нейтрофиле с сегментированным ядром, так и в НВЛ. С этой целью учитывались жизнеспособность захваченных микроорганизмов. Среднее количество жизнеспособных микроорганизмов, захваченныхнейтрофилом с неизмененной морфологией 1,18 ± 0,35, погибших микроорганизмов 1,36 ±0,20; для нейтрофильной внеклеточной ловушки данные показатели составляют 2,5 ± 0,37 и 5,55 ± 0,55 микроорганизмов соответственно. При оценке жизнеспособности Candidaalbicans (штамм 601), захваченных нейтрофильными гранулоцитами и НВЛ, установлено, что внеклеточный киллинг микроорганизмов значительно выше, чем фагоцитоз. Таким образом, образование НВЛ является механизмом не только альтернативным фагоцитозу, но и не менее эффективным.