34. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Молекулярно-биологический: обнаружение специфических участков вирусной нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Теоретически данный метод позволяет обнаружить участок одной молекулы вирусной ДНК или РНК в любом образце биологического материала. Принцип ПЦР: многократное образование (гибридизация) копий специфического участка нуклеиновой кислоты вируса с последующей их идентификацией методом электрофореза.

Определение вирусных антигенов (экспресс-диагностика): вирусные антигены определяют в крови и других биологических жидкостях с помощью серологических реакций, чаще это РИФ и ИФА (см. учебно-методическое пособие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии»).

Вирусологический: заражение исследуемым материалом биологической модели (куриный эмбрион, культура клеток, организм животного) с последующей индикацией, а затем идентификацией обнаруженных вирусов.

Для размножения вирусов в курином эмбрионе исследуемый материал вводят в аллантоисную или амниотическую полость (культивируют вирусы гриппа, эпидемического паротита и др.).

Для размножения вирусов в культуре клеток исследуемым материалом заражают живые клетки различного происхождения: эмбриональные, нормальных тканей, опухолевые (культивируют вирусы полиомиелита, аденовирусы и др.).

Для размножения вирусов в организме лабораторных животных используют белых мышей (культивируют вирусы бешенства, клещевого энцефалита).

Помимо диагностики вирусных инфекций, культивирование вирусов проводят с целью получения вакцинных и диагностических препаратов.

Вирусоскопический: обнаружение в исследуемом материале включений, образующихся в пораженных клетках при вирусной инфекции. Включения представляют собой скопления вирусов и продуктов реакции клетки на вирусную инфекцию. Включения могут располагаться в цитоплазме или в ядре клетки-хозяина. Чаще внутрицитоплазматические включения образуют РНКсодержащие вирусы (например, включения Бабеша-Негри при бешенстве). Внутриядерная локализация включений в большей степени характерна для ДНК-содержащих вирусов (например, включения при цитомегаловирусной инфекции). В мазках видны гигантские клетки с внутриядерными включениями вирусов, напоминающие «совиный глаз» (рисунок 4).

Серологический: определение противовирусных антител в сыворотке крови больного. Особенностью серологического метода диагностики вирусных инфекций является исследование парных проб сыворотки. Первую пробу сыворотки берут у больного в начале заболевания, а вторую – через 10-14 дней. О вирусной инфекции свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значимой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза.

35. Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов.

Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса:

• Если вирус способен размножаться в курином эмбрионе, то для его обнаружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на способности таких вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента «гемагглютинина», расположенного в суперкапсиде вируса. В результате реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернутого зонтика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – выпадает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации вирусов гриппа.

• Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно проводить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это действие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и изменении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение монослоя. Используют для индикации аденовирусов.

• Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных животных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства.