metodichka_7

Занятие №25

Тема. Микробиологическая характеристика дифтерии, туберкулеза, проказы.

Цель занятия. Изучить характеристику возбудителей дифтерии, туберкулеза, про-

казы, микробиологическую диагностику вызываемых ими заболева-

ний. Изучить схему бактериологического метода исследования при подозрении на дифтерию. Изучить препараты для специфической профилактики дифтерии и туберкулеза и специфического лечения дифтерии.

I.Теоретические знания:

1.Характеристика возбудителя дифтерии, микробиологическая диагностика, спе-

цифическая профилактика и лечение.

2.Характеристика возбудителей туберкулеза, микробиологическая диагностика и специфическая профилактика.

3.Характеристика возбудителя проказы, микробиологическая диагностика проказы.

II.Практические навыки:

1.Изучение схемы бактериологического исследования мазков со слизистой оболоч-

ки ротоглотки и носа больного при подозрении на дифтерию. Учет и интерпрета-

ция результатов исследования.

2.Световая микроскопия нативного препарата из мокроты больного туберкулезом,

окрашенного по Цилю-Нильсену.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Характеристика возбудителя дифтерии, микробиологическая диагностика, специфическая профилактика и лечение.

Возбудитель дифтерии – Corynebacterium diphtheriаe.

Морфо-тинкториальные свойства: грамположительные полиморфные палочки, спор, жгутиков не имеют, образуют микрокапсулу. В мазках располагаются в виде «растопыренных пальцев» или латинских букв V, X, Y. Имеют включения, представленные двумя полярно расположенными зернами волютина (полирибитилметафосфаты), которые выявляют окраской по Нейссеру.

Культуральные свойства: требовательны к питательным средам, растут на 5% кровяном и 10% сывороточном агаре. Образуют R-формы колоний: шероховатые, исчерченные, крошковидные, иногда с зонами гемолиза. На кровяно-

теллуритовом агаре образуют 3 типа колоний: gravis (крупные, сухие, черные,

шероховатые с радиальной исчерченностью и неровными краями), mitis (мелкие, гладкие, блестящие, черные, с ровными краями), intermedius (мелкие, сухие, черные колонии с более прозрачной периферией и неровными краями).

Рост C.diphtheriаe на кровяно-теллуритовом агаре.

2

Биохимические свойства: дифференциация C.diphtheriae от других видов коринебактерий основана на способности ферментировать глюкозу, сахарозу и наличии ферментов уреазы и цистиназы (табл. 1).

Факторы патогенности:

1.Факторы адгезии: микрокапсула и другие липидно-белковые вещества (обеспечивают прикрепление к клеткам эпителия верхних дыхательных путей);

2.Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза;

3.Токсинопродукция: гистотоксин, гемолизин, дермонекротоксин (вызывает некроз клеток в месте размножения возбудителя).

Основной фактор патогенности – гистотоксин (экзотоксин). Нетоксигенные штаммы C.diphtheriae не вызывают развития заболевания.

Гистотоксин состоит из двух белковых фрагментов:

Фрагмент А представляет собой фермент, блокирующий фактор элонгации трансферазу-2, ответственную за удлинение полипептидной цепи на рибосоме, что приводит к подавлению синтеза клеточного белка и гибели клеток.

Фрагмент В взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновение в клетку фрагмента А.

Токсинопродукция возбудителя дифтерии обусловлена одним из видов генетической изменчивости – лизогенной (фаговой) конверсией. Умеренный коринефаг содержит в своем геноме ген tox, кодирующий синтез гистотоксина. При интеграции ДНК умеренного фага с хромосомой дифтерийной палочки она становится токсигенной, что проявляется выработкой гистотоксина.

Источники инфекции: больной человек или бактерионоситель.

Пути заражения: воздушно-капельный, реже контактный, алиментарный. Входные ворота инфекции: слизистые оболочки ротоглотки, носа, гортани,

глаз, половых органов, поврежденные кожные покровы и др.

Дифтерия, как инфекционный процесс, развивается по интоксикационному

механизму.

Патогенез: в месте внедрения возбудителя происходит его размножение и выделение гистотоксина, который обладает как местным, так и общим действием. На слизистых оболочках формируются пленчатые фибринозные налеты, прочно спаян-

3

ные с подлежащей тканью. Повышается сосудистая проницаемость и возникает отек ткани ротоглотки и подкожной клетчатки шеи. Экзотоксин поступает в кровь и связывается с мембранами клеток органов-мишеней (миокардиоциты, почечный эпителий, клетки коркового и мозгового вещества надпочечников, периферические нервы). Ингибирование токсином белкового синтеза в клетках миокарда приводит к структурным и функциональным нарушениям тканей, способным вызвать смерть больного. В нервной ткани происходит демиелинизация волокон, приводящая к развитию параличей и парезов. В почечной ткани развивается токсический нефроз.

Клинические формы дифтерии различают по локализации, характеру течения и степени тяжести.

По локализации выделяют следующие клинические формы:

1. Дифтерия ротоглотки (90-95%).

Пленчатые фибринозные налеты при дифтерии ротоглотки.

2.Дифтерия гортани.

3.Дифтерия редких локализаций (носа, глаз, кожи, уха, половых органов и др.).

При поражении нескольких органов выделяют комбинированную форму заболевания.

Микробиологическая диагностика.

Материал на исследование: слизь или отделяемое пораженного органа (ротоглотка, нос и др.) забирают стерильным тампоном не позднее 12 часов с момента обращения больного, до назначения антибиотиков.

1.Бактериологический метод: посев исследуемого материала на 5% кровяной агар, выделение чистой культуры на 10% сывороточном агаре. Идентификацию возбудителя проводят по морфо-тинкториальным, культуральным, биохимическим свойствам и по определению продукции экзотоксина (гистотоксина).

2.ПЦР: определяют ДНК C.diphtheriae и наличие гена tox+.

Для определения гена tox+помимо ПЦР используют ИФА, РНГА и реакцию преципитации в геле (см. учебно-методическое пособие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии»).

4

Специфическая профилактика дифтерии:

АКДС-вакцина (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина). АДС-анатоксин (адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин). АДС-м-анатоксин (дифтерийно-столбнячный анатоксин с пониженным содержани-

ем антигенов).

АД-м-анатоксин (очищенный адсорбированный дифтерийный анатоксин с пониженным содержанием антигена).

Препараты с пониженным содержанием антигенов предназначены для профилактики у детей старше 6 лет, подростков и взрослых.

В настоящее время для профилактики дифтерии также используются зарубеж-

ные препараты.

Для выявления уровня коллективного противодифтерийного иммунитета определяют его напряженность серологическим методом в РНГА, ИФА.

Специфическое лечение дифтерии: сыворотка противодифтерийная антитоксическая лошадиная очищенная. Сыворотку вводят дробно (см. учебно-

методическое пособие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии»).

2.Характеристика возбудителей туберкулеза, микробиологическая диагностика и специфическая профилактика.

Микобактерии широко распространены в окружающей среде и могут вызывать различные заболевания: туберкулез, туберкулезоподобные заболевания, другие микобактериозы, проказу.

Вызывающие туберкулез виды микобактерий объединены в комплекс Mycobacterium tuberculosis, включающий: M.tuberculosis (92%), M.bovis (5%) (возбу-

дитель туберкулеза крупного рогатого скота), M.africanum (3%).

Морфо-тинкториальные свойства: тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки. Реже встречаются зернистые и нитевидные формы. Спор, капсулу, жгутиков не имеют. Кислотоустойчивы за счет наличия в клеточной стенке высокого содержания липидов и миколовых кислот. По методу Циля-Нильсена окрашиваются в красный цвет.

M.tuberculosis в мокроте. Окраска по Цилю-Нильсену.

5

Культуральные свойства: аэробы, требовательны к условиям культивирования, длительно (3-8 недель) растут на плотных (среда Левенштайна) и жидких питательных средах с обязательным присутствием различных факторов роста. На плотных питательных средах образуют сухие морщинистые кремового цвета колонии (R-форма).

Рост M.tuberculosis на плотной питательной среде.

Основной фактор патогенности: корд-фактор (токсический гликолипид кле-

точной стенки). Его действие: вызывает гибель фагоцитов; подавляет миграцию лейкоцитов;

оказывает токсическое действие на ткани.

Возбудитель сенсибилизирует ткани и вызывает характерную для туберкулеза

аллергическую реакцию гиперчувствительности замедленного типа.

Источник инфекции: больной человек.

Пути заражения: аэрогенный, алиментарный, контактно-бытовой.

Основная клиническая форма заболевания: туберкулез легких.

Патогенез: в зоне проникновения микобактерий возникает первичный туберкулезный комплекс, состоящий из воспалительного очага некроза, пораженных регионарных лимфатических узлов и «дорожки» измененных лимфатических сосудов между ними. Распространение микробов может происходить бронхогенно, лимфогенно и гематогенно. При заживлении очаг воспаления рассасывается, некротические массы уплотняются, а вокруг формируется соединительнотканная капсула (очаг Гона), микобактерии трансформируются в L-формы. Активация этих очагов ведет к развитию вторичного туберкулеза.

Иммунитет нестерильный, обусловлен наличием в организме L-форм микобактерий. Основной механизм иммунитета – клеточный.

В развитии болезни выделяют первичный, диссеминированный и вторичный туберкулез.

6

Различают 3 клинические формы заболевания: первичная туберкулезная интоксикация у детей и подростков, туберкулез органов дыхания, туберкулез других органов и систем.

Микробиологическая диагностика.

Материал на исследование: мокрота (3 раза с интервалом 2-3 дня), промывные воды бронхов и др.

1.Бактериоскопический метод:

-световая микроскопия в окраске по Цилю-Нильсену;

-люминесцентная микроскопия.

Для повышения концентрации возбудителя в исследуемом материале используют методики обогащения, например, флотацию: мокроту гомогенизируют, затем добавляют ксилол, толуол или бензин, смесь встряхивают, добавляют дистиллированную воду. Ксилол вместе с микобактериями всплывает наверх в виде пленки. Из нее готовят мазки.

2.Бактериологический (основной) метод:

-посев на плотные питательные среды;

-использование автоматизированных систем (BACTEC и др.) – сочетание плотной и жидкой питательных сред.

3.ПЦР.

4.Аллергологический (туберкулинодиагностика) метод: ранняя диагностика ту-

беркулеза у детей и подросток (внутрикожная проба Манту с туберкулином). Проба свидетельствует не о заболевании, а об инфицировании.

7

В дополнение к пробе Манту применяют диаскинтест с аллергеном туберкулезным рекомбинантным, который содержит антигены только вирулентных штаммов M. tuberculosis. Положительная реакция на этот аллерген бывает только у лиц, инфицированных возбудителем туберкулеза, и отсутствует у лиц, вакцинированных БЦЖ.

Специфическая профилактика – живая туберкулезная вакцина BCG, жи-

вая туберкулезная вакцина BCG-м.

3. Характеристика возбудителя проказы, микробиологическая диагностика.

Возбудитель проказы (лепры) – Mycobacterium leprae.

Морфо-тинкториальные свойства: прямые или слегка изогнутые палочки, неподвижны, спор и капсулу не имеют. Кислотоустойчивы, окрашиваются по ЦилюНильсену в красный цвет. В мазках из очагов поражения располагаются внутриклеточно шаровидными скоплениями или параллельными группами («пачки сигар»).

M.leprae в мазке из очага поражения. Окраска по Цилю-Нильсену.

Культуральные свойства: не растут на питательных средах. Являются облигатными внутриклеточными паразитами.

Источник инфекции: больной человек.

Пути заражения: воздушно-капельный, контактный.

Для проказы характерен очень длительный инкубационный период (в среднем 3-7 лет, но может удлиняться до 15-20 лет).

Патогенез: возбудитель проникает через слизистые оболочки и кожу в лимфатические и кровеносные капилляры, нервные окончания и медленно распространяется по организму. M.leprae обладает тропизмом к тканям с низкой температурой (<300C). Это приводит к формированию гранулем различной поверхностной локализации.

Основные клинические формы:

-туберкулоидная – характеризуется поражениями кожи (одиночные, слегка пигментированные пятна), периферических нервов (нарушается температурная, бо-

левая и тактильная чувствительность);

8

-лепроматозная – характеризуется высыпаниями на коже и слизистых оболочках носа и ротовой полости, которые затем превращаются в инфильтраты (лепромы). При диффузной инфильтрации лицо больного напоминает морду льва. На поздней стадии болезни образуются множественные лепромы, выпадают брови и ресницы, формируются парезы, параличи;

-недифференцированная (сочетанная) форма характеризуется кожными высыпаниями и поражением периферических нервных стволов (моно- и полиневриты).

Микробиологическая диагностика.

1.Бактериоскопический метод при лепроматозной форме заболевания – окраска мазков из исследуемого материала по Цилю-Нильсену. Материал на исследование: соскобы с кожи и со слизистых оболочек носа, пунктаты лимфатических узлов.

2.Серологический метод: ИФА.

3.ПЦР.

Специфическая профилактика и специфическое лечение не разработаны.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА.

1.Изучение схемы бактериологического исследования мазков со слизистой оболочки ротоглотки и носа больного при подозрении на дифтерию.

I этап исследования.

Посев исследуемого материала на 5% кровяной агар. Посевы инкубируют при 370С 24 часа.

II этап исследования.

1.Изучение характера роста на кровяном агаре, приготовление мазков из подозрительных колоний, окраска по Нейссеру, микроскопия.

2.С целью выделения чистой культуры производят пересев подозрительных колоний на 10% сывороточный агар. Посевы инкубируют при 370С 24 часа.

III этап исследования.

1.Изучение чистоты выделенной культуры макро- и микроскопически.

2.С целью идентификации выделенной культуры производят посев в среды с глюкозой, сахарозой, мочевиной и цистином. Для определения токсигенности культуры ставят реакцию преципитации в геле.

IV этап исследования.

1.Учет биохимических свойств.

2.Учет пробы на токсигенность.

3.Вывод (определение вида выделенной культуры и ее токсигенности).

2.Световая микроскопия препарата из мокроты больного туберкулезом в окраске по Цилю-Нильсену.

9

Занятие №26

Тема. Микробиологическая характеристика патогенных анаэробов.

Цель занятия. Изучить характеристику возбудителей неклостридиальных анаэроб-

ных инфекций, возбудителей газовой гангрены, столбняка, ботулиз-

ма, микробиологическую диагностику вызываемых ими заболеваний.

Изучить схему бактериологического метода исследования при по-

дозрении на газовую гангрену. Изучить препараты для специфиче-

ской профилактики и специфического лечения газовой гангрены,

столбняка, ботулизма.

I.Теоретические знания:

1.Неклостридиальные анаэробы в патологии человека, микробиологическая диаг-

ностика.

2.Характеристика возбудителей газовой гангрены, микробиологическая диагно-

стика, специфическая профилактика и лечение.

3.Характеристика возбудителя псевдомембранозного колита, микробиологическая диагностика.

4.Характеристика возбудителя столбняка, специфическая профилактика и лечение.

5.Характеристика возбудителя ботулизма, микробиологическая диагностика, спе-

цифическое лечение.

II.Практические навыки:

1.Изучение схемы бактериологического исследования отечной жидкости при по-

дозрении на газовую гангрену. Учет и интерпретация результатов исследования.

2.Световая микроскопия готовых препаратов чистых культур бактероидов, возбу-

дителей газовой гангрены, столбняка, ботулизма, окрашенных по Граму.

1