6.Виды микроскопии, используемые в медицинской микробиологии.

СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.

При исследовании микроорганизмов применяют иммерсионный объектив. Его преимущество – с помощью иммерсионного масла устанавливается оптически однородная среда с одинаковым показателем преломления между стеклом и линзой. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, чем достигается более высокая разрешающая способность. В качестве иммерсионного масла обычно используют кедровое или касторовое, показатель преломления которых равен показателю преломления света в стекле.

ТЕМНОПОЛЕВОЙ МИКРОСКОП (ультрамикроскоп). Разрешающая способность – 0,02-0,04 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и подвижности живых, неокрашенных бактерий.

Темное поле создается с помощью специального конденсора, в котором затемнена центральная часть и таким образом создается боковое освещение. Поэтому в объектив попадают лучи, отраженные от объекта. Увеличение разрешающей способности микроскопа связано с тем, что отраженный луч имеет более короткую длину волны.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, подвижности и структуры живых неокрашенных бактерий.

Имеет специальный набор фазовых объективов и соответствующих им кольцевых диафрагм конденсора. С помощью этого устройства достигается преобразование невидимых фазовых колебаний преломленного луча в видимые амплитудные колебания.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых ультрафиолетовых (УФ) лучей. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, аурамин и др.). В качестве источника УФ-света обычно используют ртутнокварцевую лампу. Под действием УФ-излучения окрашенные клетки начинают светиться красным или зеленым светом.

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем).

Предназначен для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных макромолекул.

Высокая разрешающая способность достигается малой длиной волны электронов. В электронном микроскопе вместо света используют поток электронов в безвоздушной среде. Источником электронов является вольфрамовая нить катода, разогреваемая до высокой (2500-2900⁰С) температуры. Роль оптических линз выполняют электромагниты. Для исследования препаратов в электронном микроскопе применяют специальные пленки, проницаемые для электронов.

7. Окраска по Граму. Механизм окраски. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Окраска по Граму (в модификации Синѐва):

• на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генциан-фиолетовым, смачивают водой, окрашивают 2 минуты;

• снимают бумагу и наносят на мазок раствор Люголя на 1 минуту, затем краситель сливают;

• обесцвечивают мазок 96^о спиртом 10-15 секунд;

• промывают мазок водой;

• докрашивают мазок фуксином Пфейффера 30 секунд;

• промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Механизм окраски по Граму.

Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бактерии зависит от строения клеточной стенки, основой которой является пептидогликан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана 500Å, у грамотрицательных – не более 150Å.

При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Люголя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположительных бактерий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашивании фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобретают розово-красный цвет.

В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные (сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные).

К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий) и спорообразующие бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспорообразующие бактерии, спириллы.