Антибиотики

β-Лактамные антибиотики: промышленное получение

ВВЕДЕНИЕ. В молекуле пенициллина в гетероцикле

для производства полусинтетических пенициллинов

три стереоспецифических центра, следовательно,

и цефалоспоринов. В современном производстве хи-

при химическом синтезе могут образовываться во-

мический гидролиз практически полностью заменен

семь стереоизомеров (3(S):5(R):6(R)), из которых

на ферментативный гидролиз под действием иммо-

лишь один стереоизомер проявляет биологическую

билизованной пенициллин-G-амидазы из E. coli. Оп-

активность. По сравнению с химическим синтезом

тимальными условиями для реакции гидролиза явля-

ферментация с использованием оптимизированных

ются рН 7,5–8,0 и температура 35–40 °С. Высокая

штаммов Penicillium chrysogenum представляется

стабильность фермента позволяет повторять цикл

значительно более выгодной с экономической точки

до 1000 раз, поэтому реакцию проводят в непрерыв-

зрения. Добавление в среду роста алифатических

ном режиме. В результате последующей очистки

или ароматических карбоновых кислот позволяет по-

продукта

осаждением и фильтрацией получают

лучать различные производные – предшественники

6-АРА высокой степени чистоты, а затем ее либо

других антибиотиков, среди которых наибольшее

подвергают ацилированию по положению 6 для полу-

значение имеют пенициллины V и G. Пенициллин G

чения полусинтетических пенициллинов, либо пре-

используется для производства 6-аминопеницилла-

вращают в 7-ADCA – промежуточное соединение в

новой кислоты (6-АРА) – важнейшего продукта при

синтезе цефалоспоринов.

получении полусинтетических пенициллинов и цефа-

ЦЕФАЛОСПОРИНЫ И 7-A(D)CA. Метод ферментатив-

лоспоринов.

ного получения цефалоспоринов с использованием

ПЕНИЦИЛЛИН G И 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВАЯ КИС-

Acremonium chrysogenum аналогичен

описанному

ЛОТА (6-АРА). В промышленности при получении пе-

выше способу производства пенициллинов, однако

нициллина G используют штаммы-суперпродуценты

в случае цефалоспоринов выход продукта несколько

P. chrysogenum, культуру которых выращивают в био-

ниже. A. chrysogenum не имеет собственной N-транс-

реакторах с рабочим объемом до 200 м3. Чтобы из-

ацетилазы, поэтому все полусинтетические антибио-

бежать подавления роста клеток катаболитами, фер-

тики ряда цефалоспоринов синтезируют на основе

ментацию осуществляют в непрерывном режиме,

7-аминоспорановой кислоты (7-АСА) или ее дезаце-

т. е. в биореактор постоянно подают свежую культу-

токсипроизводного (7-ADCA). 7-ACA получают путем

ральную среду. Для образования и роста мицелия

гидролиза в мягких условиях. По экономическим и

грибов необходимо хорошее снабжение кислородом,

экологическим причинам все большее распростране-

поэтому в ферментерах предусмотрены специальные

ние приобретает двухстадийный процесс. Получение

приспособления для аэрации и тщательного переме-

7-АСА начинается с иммобилизованной оксидазы D-

шивания культуры. Сложная питательная среда

аминокислот. На этой стадии путем окислительного

содержит лактозу в качестве источника углерода,

дезаминирования образуется α-кетоадипил-7-ACA,

а жидкий кукурузный экстракт служит источником

которая спонтанно декарбоксилируется до глутарил-

азота. Синтез антибиотиков начинается примерно че-

7-ACA. В ходе реакции, катализируемой иммобили-

рез 40 ч, т. е. по окончании фазы роста. Идиофаза –

зованной

глутарил-7-ACA-ацилазой,

образуется

период, когда происходит синтез антибиотиков, –

7-ACA. Из нее можно получить до 50 полусинтетиче-

длится около 100 ч, и в это время в среду добавля-

ских цефалоспоринов. Одностадийный гидролиз осу-

ют фенилуксусную кислоту. Клетки секретируют пе-

ществляют с использованием цефалоспорин-7-аци-

нициллин G в культуральный бульон. После отделе-

лазы. Для получения 7-ADCA и производных

ния мицелия фильтрацией или центрифугированием

цефалоспоринов используют рекомбинантные штам-

культуральную жидкость подвергают двухстадийной

мы Penicillium chrysogenum, в которых клонирован ген

экстракции с использованием амилацетата (или бу-

экспандазы из Acremonium chrysogenum или Strepto-

тилацетата) при рН 2,5–3,0 и 0–3 °С. Метод основан

myces clavuligerus. Образующаяся адипил-ADCA рас-

на том, что большинство антибиотиков хорошо рас-

щепляется амидазой (например, из Pseudomonas

творяются в органических растворителях, практиче-

diminuta). Расширение кольца пенициллина до деза-

ски не смешивающихся с водой. Непрерывную экс-

цетоксицефалоспорина также возможно во внекле-

тракцию антибиотика из водной фазы в органическую

точных условиях с использованием иммобилизован-

можно осуществлять в противоточном режиме, при

ных ферментов.

котором две жидкие фазы движутся в противополож-

ных направлениях. Затем первичный продукт (около

3 т/сут. в биореакторе с объемом 110 м3) перекри-

сталлизовывают. Следующий этап переработки за-

46

ключается в гидролизе пенициллина G с образовани-

ем 6-АРА – важнейшего соединения, необходимого

Методы синтеза

Penicillium chrysogenum

Ферментация

Дополнительные

На среде с фенилуксусной кислотой

Ферментативный катализ

химические реакции

Экспандаза;

Acremoneum chrysogenum

Ферментация

глутариловая

кислота

Пенициллин G

Иммобили-

Цефалоспорин С

зованная

Глутарил-3-дезацетокси-

Иммобили-

пенициллин-G-

амидаза

цефалоспорин*

зованный

фермент

6-Аминопенициллановая

7-Аминодезацетоксицефало-

7-Аминоцефало-

кислота (6-АРА)

спорановая кислота (7-ADCA)

спорановая кислота (7-АСА)

Полусинтетические пенициллины

Полусинтетические цефалоспорины

* Производное 7-ADCA за счет расширения цикла пенициллина (in vivo) или 6-АDA (биотехнологическим путем)

Промышленное получение β-лактамных антибиотиков

Антибиотики пенициллинового ряда

Антибиотики цефалоспоринового ряда

Посевной материал

Посевной материал

Суспензия спор P. chrysogenum

Суспензия спор А. chrysogenum

Предферментация, ферментация

Предферментация, ферментация

Лактоза, жидкий кукурузный экстракт, CaCO3;

Ферментация с добавлением субстрата, усиленное

ферментация с добавлением субстрата (глюкозы),

снабжение кислородом в течение 120 ч;

усиленное снабжение кислородом; добавление

добавление жирных кислот, например

веществ-предшественников, например D-фенил-

метилолеата, приводит к повышению выхода

уксусной кислоты, приводит к образованию био-

продукта; > 17 г/л после 150 ч ферментации

синтетических пенициллинов;

выход: > 30 г/л после 120 ч ферментации

Первичная обработка

Первичная обработка

1) Отделение мицелия

1)

Отделение мицелия

2) Экстракция в противотоке с использованием

2)

Ионообменная хроматография, осаждение

амилацетата или бутилацетата

или адсорбция на амберлите ХАD

Ферментативный гидролиз

Реакция

Химический гидролиз

с образованием 6-АРА

расширения кольца

с образованием 7-АСА

Иммобилизованная

Четырехстадийная

Иммобилизованные оксидаза

пенициллин-G-амидаза из E. coli,

химическая реакция,

D-аминокислот и глютарил-

в непрерывном режиме, при 37 °C

выход ~ 70%

7-АСА-ацилаза, выход > 90%

Полусинтетические пенициллины

Полусинтетические цефалоспорины

Присоединение ацильных боковых групп

Присоединение ацильных боковых групп

(реакция Шоттена–Баумана)

(реакция Шоттена–Баумана)

47

Антибиотики

Пептидные антибиотики

и антибиотики – производные аминокислот

ВВЕДЕНИЕ. В предыдущем разделе обсуждались ме-

организмов. Нерибосомный синтез пептидов возмо-

тоды получения β-лактамных антибиотиков – важней-

жен благодаря функционированию специальных фер-

шей группы антибиотиков, применяемых в медицине.

ментных комплексов – синтетаз, по строению сход-

В настоящее время продемонстрировано антимикроб-

ных с синтетазой жирных кислот у эукариот.

ное действие более 500 веществ, состоящих из пеп-

В этих ферментативных реакциях образуются корот-

тидов или являющихся производными аминокислот.

кие линейные полипептиды, которые затем замыка-

Некоторые из этих соединений используются в меди-

ются в цикл, образуя, например, лантибиотики. Раз-

цине, в частности для стимуляции заживления ран,

мер таких пептидов, как правило, не превышает

а другие нашли применение в сельском хозяйстве.

20 аминокислотных остатков. Они формируют в

К этой группе антибиотиков относятся циклосерин,

фосфолипидной мембране каналы, проницаемые

фосфинотрицин, циклические пептидные антибиотики

для катионов. Кроме того, в их состав часто входят

(грамицидин, бацитрацин), хелатообразующие пепти-

небелковые аминокислоты, а также дополнительные

ды (блеомицин), хромопептиды (актиномицин), а так-

структурные элементы. Большинство пептидных ан-

же депсипептиды (виргиниамицин). Большинство

тибиотиков, синтезированных вне рибосом, являют-

этих соединений получают из клеток стрептомицетов,

ся сильными токсинами, поэтому они применяются

а некоторые – из других грамположительных микро-

лишь для специальных целей, например для зажив-

организмов, в том числе стрептококков и бацилл.

ления ран или ожогов. Бацитрацин применяется в

АНТИБИОТИКИ – ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТ.

качестве кормовой добавки; циклоспорин из Tolypoc-

Образующийся в процессе жизнедеятельности Strep-

ladium inflatum – иммуносупрессор (назначается при

tomyces orchidaceus D-циклосерин представляет

трансплантации органов). Колистин (полимиксин Е)

собой аналог D-аланина – вещества, входящего в со-

из клеток Bacillus polymyxa иногда используется

став муреина клеточной стенки бактерий. Антибак-

как антибактериальный препарат при лечении

териальное действие D-циклосерина заключается

инфекций, вызванных грамотрицательными бакте-

в ингибировании

аланинрацемазы,

участвующей

риями. Цитостатик блеомицин, образующийся в

в синтезе муреина. В отличие от многих других анти-

клетках Streptomyces verticillus, относится к важ-

биотиков D-циклосерин действует на Mycobacterium

ным препаратам противораковой терапии. Блеоми-

tuberculosis, поэтому в сочетании с рифампицином

цин в комплексе с Fe2+ способен действовать в

он показан при лечении туберкулеза легких (заме-

качестве ДНКазы, т. е. осуществлять разрывы в дву-

тим, что в Западной Европе в последние годы

цепочечной ДНК. Актиномицин, синтезирующийся

туберкулез почти не встречается). Аланил-аланил-

многими штаммами Streptomyces, узнает в молекуле

фосфинотрицин,

выделенный из

Streptomyces

ДНК палиндромную последовательность 5'-TGAC-3'

hygroscopicus, является аналогом L-глутамина и ин-

и взаимодействует с нею, блокируя трансляцию

гибирует глутаминсинтетазу растений. Промышлен-

ДНК, и в результате останавливает транскрипцию

ное получение фосфинотрицина (Glyphosat®, Ba-

(при высоких концентрациях – репликацию). Ранее

sta®) основано на химическом синтезе этого

актиномицин использовался в противораковой тера-

соединения. Клонирование гена ацетилтрансферазы

пии. В антибиотиках группы депсипептидов, действу-

из S. hygroscopicus в сельскохозяйственных растени-

ющих на грамположительные бактерии, аминокис-

ях обеспечивает устойчивость трансгенных растений

лотные остатки соединены между собой поочередно

к фосфинотрицину.

эфирными и амидными связями. Один из предста-

ПЕПТИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ. Пептидные антибиотики

вителей этого ряда препаратов виргиниамицин –

синтезируются как на рибосомах, так и вне их. Син-

продукт жизнедеятельности Streptomyces virginiae и

тез на рибосомах приводит к образованию линейных

широко применяется при откорме скота и в птице-

полипептидов, которые подвергаются посттрансля-

водческом хозяйстве. Ряд сидерохромов представ-

ционным модификациям. Примером такой модифи-

лен пептидными антибиотиками, содержащими ионы

кации может служить реакция эпимеризации – пре-

железа и гидроксамовую кислоту. Они используются

вращение L-аминокислоты в D-аминокислоту. Так,

при лечении заболеваний, связанных с нарушениями

низин – пептидный антибиотик, образующийся на

обмена железа.

рибосомах в клетках некоторых штаммов молочно-

кислых бактерий. Его антимикробное действие за-

ключается в ингибировании образования цитоплаз-

матической мембраны грамотрицательных бактерий,

поэтому препарат низина используют в производстве

48

кисломолочных продуктов в качестве консервирую-

щего средства, препятствующего росту других микро-