Генная терапия in vivo |
|
Вектор на основе генома ретровируса |
|||
|
кДНК человека |
Геном ретровируса |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Вектор |
|
|
|
|
|
с полноценным |
Вектор на основе генома ретровируса |
|||
|
геном |
||||
|
|
|
5'-Концевая последовательность |
||
|
|
|
инициации транскрипции |
||
|
|
|
Обратная транскриптаза, интеграза |
||
|
|
|
Белок капсида вируса |
||
|
|
|
Конструкция, несущая кДНК человека |
||
|
|
|
Промотор |
|
|
|
|
|
Селективный маркер, например, |
||
|
|
|
устойчивости к неомицину (NeOR) |
||
|
|
|
3'-Концевая последовательность |
||
|
|
|
с сигналом полиаденилирования |
||
Генная терапия ex vivo (на примере стволовых клеток) |
|
|
|||
Трансфекция |
|
Т-клетки |
|
В-клетки |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
кДНК человека |
Имплантация |
|
|
Базофилы |
|
Взятые |
|
|
|
||
у пациента |
|
клеток пациенту |
|
|
|
стволовые |
|
|
|
|
|
клетки |
|
|
|
|
|
Вектор, |
|
Дифференцировка |
|
|
Моноциты |
|
|
|
|
||
несущий |
|
|
|
|
|
|
клеток |
|
|
Нейтрофилы |
|
полноценный |
|
|
|||
ген |
Все зрелые клетки несут нормальный ген |
Эозинофилы |
|||
|
|||||
Векторы для генной терапии |
|
|
|
|
|
Ретровирусы |
Аденовирусы |
Адено- |
Липосомы |
|
Чистая ДНК |
|
|
ассоциирован- |
|
|
|
|
|
ные вирусы |
Липидная мембрана |
|
|
|
|
|
|
||
Преимущества |
Преимущества |
Преимущества |
Преимущества |
|
Преимущества |
Стабильное |
Можно встраивать |
Стабильное |
Нет риска возникно- |
Нет риска возникно- |
|
встраивание в геном |
крупные |
встраивание |
вения заболевания |
вения заболевания |
|
Недостатки |
фрагменты ДНК |
в геном |
в результате терапии |
в результате терапии |
|
Инфицируют |
Недостатки |
Недостатки |
Недостатки |
|
Недостатки |
случайным образом |
Нестабильное |
Можно встраивать |
Невысокая |
|
Невысокая эффектив- |
только делящиеся |
встраивание |
только небольшие |
эффективность |
|
ность доставки ДНК, |
клетки |
в геном |
фрагменты ДНК |
доставки ДНК |
|
нестабильная система |
Применение генной терапии (2004 г.) |
|
|
|
||
|
Заболевание |
Примеры/перенесенные гены |
|
|
|
Злокачественные опухоли |
Гены комплекса гистосовместимости, гены-супрессоры опухолей, |
|
|
|
(более 2000 пациентов, 675 протоколов) |
суицидные гены, IL-2, IL-7 и IL-12, противоопухолевые антитела |
|
|
|
Моногенные заболевания |
Ген SCID-ADA, муковисцидоз, фактор IX, |
|
|
|
(более 300 пациентов, 93 протокола) |
хронический гранулематоз |
|
|
|
Инфекционные заболевания, в основном СПИД |
Трансгенные Т-лимфоциты, ДНК-вакцины |
|
|
|
(около 400 пациентов, 68 протоколов) |
|
|
|
|
Другие заболевания |
VEGF121 (атеросклероз), ревматоидный артрит |
|
|
|
(более 70 пациентов, 184 протокола) |
|
|
|
|
|
|
|
269 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
развития |
Поиск биологически активных веществ |
||
ВВЕДЕНИЕ. Поиск новых лекарств или химикатов для |
в 96или 384-гнездных микротитровальных планше- |
||
|
|||
Тенденции |
сельскохозяйственных нужд традиционно проводился |
тах. Использование реакционных камер с объемом |
|
ствуют в организме на определенный белок (или бел- |
НЫХ ВЕЩЕСТВ. Несмотря на то что пространственные |
||
|
методом проб и ошибок. Естественно-научные знания |
~10–9 л на основе травленых кремниевых плат в со- |
|
|
и новые технологии позволяют сделать этот поиск |
четании с конфокальной лазерной спектроскопией |
|
|
более рациональным. В основе такого подхода лежит |
позволяют провести более 10 000 измерений в день. |
|
|
идея о том, что биологически активные вещества дей- |
РАЦИОНАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВ- |
|
|
ки), называемые мишенями. В роли мишеней могут |
структуры большинства белков-мишеней неизвест- |
|
|
выступать ферменты, рецепторы, белки ионных кана- |
ны, делаются попытки поиска сайтов связывания ми- |
|
|
лов, в случае растений – белки, участвующие в фото- |
шеней с биологически активными веществами. Для |
|
|
синтезе. Анализ генома и применение методов |
этого исследуют взаимодействие мишеней с различ- |
|
|
протеомики позволяют значительно эффективнее |
ными синтетическими аналогами природных субстра- |
|
|
проводить поиск мишеней. Методами генетической |
тов (QSAR – quantative structure – activity relations- |
|
|
инженерии можно выделить эти белки, а затем изу- |
hip). Полученные данные помогают изучать структуру |
|
|
чить их взаимодействие с природными и синтетиче- |
биологически активного вещества и усовершенство- |
|
|
скими веществами. На основе полученных данных о |
вать его в соответствии с поставленными целями |
|
|
структуре действующего вещества в дальнейшем воз- |
(drug design). |
|
|
можно создание модифицированных соединений, об- |
ПЕРСПЕКТИВЫ. На сегодняшний день из 50 000 ис- |
|
|
ладающих определенной биологической активностью |
следованных соединений лишь одно доходит до ста- |
|
|
и некоторыми дополнительными свойствами. Скриниг |
дии лекарственного препарата. В год в мире появля- |
|
|
с применением методов химической комбинаторики и |
ется около 30 новых фармацевтических продуктов. |
|
|
современных биохимических данных позволяет полу- |
Специалисты в области фармакологии надеются, что |
|
|
чать новые лекарственные вещества. |
с применением направленного скрининга это число |
|
|
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ МИШЕНЕЙ. Несмот- |
значительно возрастет. Анализ связанных с патоло- |
|
|
ря на значительный прогресс биотехнологии в пос- |
гией полиморфизмов должен выявить возможные |
|
|
ледние десятилетия, идентификация мишеней, в осо- |
индивидуальные отклонения в структуре гена-мише- |
|
|
бенности в случае полигенных заболеваний, остается |
ни, вызывающие те или иные проявления заболева- |
|
|
весьма сложной задачей. Исследование генофонда |
ния. Эта информация поможет устанавливать диаг- |
|
|
замкнутых популяций, например в Исландии или Тас- |
ноз на ранних стадиях заболевания и подбирать |
|
|
мании, и изучение геномов больных в этих популя- |
лекарственные средства, наиболее подходящие для |
|
|
циях способствовали определенному прогрессу в |
каждого конкретного пациента (фармакогеномика). |
|
|
этой области. Если удалось установить связь между |
|
|
|
дефектом фермента, ионного канала или рецептора и |
|
|
|
проявлениями заболевания, на следующем этапе по- |
|
|
|
лучают лабораторное животное, в котором «подозре- |
|
|
|
ваемый» ген выключен, например, с помощью анти- |
|
|
|
смысловой РНК. К примеру, если G-связанный |
|
|
|
рецептор распознается как мишень, он может быть |
|
|
|
локализован в мембране фибробластов мыши. В ка- |
|
|
|
честве цитоплазматического репортера используют |
|
|
|
экспрессию люциферазу светляка. Как только лиганд |
|
|
|
связывается с рецептором, происходит передача сиг- |
|
|
|
нала путем повышения концентрации цАМФ в цито- |
|
|
|
плазме, что приводит к развитию доступного для ко- |
|
|
|
личественной оценки люминесцентного сигнала при |
|
|
|
наличии субстрата люциферазы – люциферина. |
|
|
|
МАСШТАБНЫЙ СКРИНИНГ. Наиболее распространен- |
|
|
|
ный современный метод масштабного скрининга за- |
|
|
|
ключается в исследовании действия веществ из об- |
|
|
|
ширных библиотек химических соединений (более |
|
|
|
100 000 соединений) на мишень. Получение библи- |
|
|
|
отек методом химической комбинаторики позволяет |
|
|
270 |
практически безгранично увеличить количество ве- |
|
|
ществ в библиотеке. Такого рода измерения проводят |
|
||
Скрининг биологически активных веществ |
|
|||
Природные вещества, |
Биологические мишени, например, |
Литературные данные, |
||
пептиды, синтетические |
||||
из анализа генома или протеома |
вещества-аналоги |
|||
вещества, комбинаторная |
||||
|
|
|
||
химия |
|
|
|
|
|
Экспериментальная модель, |
|
||
|
масштабный скрининг |
|
||
|
|
Основная структура |
Фармацевтические |
|
|
|
требования, |
||
|
|
активного вещества |
||
|
|
побочные явления |
||
|
|
|
||
|
Концепция эксперимента, синтеза |
|
||
Биологическая проверка |
|
|
Определение структуры, |
|
|
|
компьютерный дизайн |
||
|
|
|
||
|
Установление связи между структурой |
|
||
|
и действием вещества, QSAR |
|
||
Связь с интересующими свойствами |
Выбранное вещество |
Лекарственный препарат |
||
Мишени |
|
|
|
|
|
Количество |
Пример |
Применение |
|
в организме человека |
|
|
Ферменты |
8 000 |
Ацетилхолинэстераза |
Болезнь Альцгеймера |
Рецепторы |
15 000 |
Рецептор серотонина |
Шизофрения |
Ионные каналы |
3 000 |
Са-канал |
Болезни старческого возраста |
|
|
|
|
Масштабный скрининг |
Клетки-мишени на микротитровальном |
планшете |
СО2-инкубатор* |
Добавление веществ–кандидатов |
и реагентов |
Анализатор |
Автоматизированное нанесение проб |
Отмывка планшета |
Центрифугирование планшета |
Автоматизированное управление |
процессом |
* Необходим только при использовании |
в качестве мишеней культур клеток |
человека или животных |
Рациональный дизайн биологически активных веществ |
|
|
|
Трехмерная |
|
Предложенный |
|
|
|
Синтетические |
|
|
|
Биологически |
|
|
|
|||||||||
|
|
|
структура или |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
структурная модель |
|
|
|
лиганд |
|
|
|
соединения |
|
|
|
|
активен? |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Отходы |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
Определение структуры |
Химический синтез лигандов |
|
|
|
Цикл 1 |
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
белка или создание модели |
Биологический тест |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
Цикл 2 |
и т. д.: |
|||||||||||||||||||
|
|
Дизайн лигандов |
Определение структуры или |
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
оптимизация |
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
создание модели мишени и лиганда |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
271 |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|