- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Биотехнология в сельском хозяйстве
Генетическая ферма и ксенотрансплантация
ВВЕДЕНИЕ. Для сельского хозяйства большой инте- |
ре VIII (120 г). Пока, однако, получать медицинские |
рес представляют трансгенные животные, обладаю- |
препараты таким методом не разрешается. |
щие «улучшенными» признаками. Однако из-за доро- |
КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИЯ. Благодаря трансплантации |
говизны методов и бурных общественных дискуссий |
были спасены жизни более 200 000 человек. В США |
об этических аспектах и мерах безопасности при раз- |
трансплантации сердца ожидают около 45 000 чело- |
ведении трансгенных животных в настоящее время |
век, однако ежегодно лишь 2000 человек получают |
их не используют для получения пищевых продуктов. |
«новое» сердце. В качестве доноров органов могут |
На генетических фермах выращивают трансгенных |
быть использованы трансгенные животныe. Лучше |
мышей, овец, коз или коров и получают важные с ме- |
всего из домашних животных для этого подходят сви- |
дицинской точки зрения белки в молоке, откуда их |
ньи, поскольку их органы и органы человека имеют |
легко выделить. Такой метод, как и в случае транс- |
сходный размер, анатомию и физиологию. Основной |
генных растений, позволяет значительно увеличить |
проблемой при ксенотрансплантации является реак- |
выход продукта и может конкурировать с методами |
ция отторжения чужеродных органов. При этом раз- |
синтеза рекомбинантного белка в клетках или в био- |
личают 1) гиперострое отторжение (от секунд до не- |
реакторе. Трансгенных свиней выращивают для полу- |
скольких минут), которое вызвано быстрой |
чения органов для ксенотрансплантации (прежде |
активацией системы комплемента реципиента; |
всего трансплантации сердца). |
2) острое отторжение (сутки), обусловленное реак- |
ЖИВОТНОВОДСТВО. Основной целью создания |
цией Т-клеток, встречается также при пересадке ор- |
трансгенных сельскохозяйственных животных явля- |
ганов от одного человека другому; 3) хроническое от- |
ется увеличение их веса, что достигается за счет эн- |
торжение (до нескольких лет), точные причины |
догенного синтеза соматотропина в результате пере- |
которого пока не установлены. При пересадке орга- |
носа генов. Кроме того, животноводы пытаются |
нов из организма другого вида первоочередной зада- |
повысить устойчивость животных к стрессу и болез- |
чей является предотвращение гиперострого отторже- |
ням, а также улучшить ряд качественных признаков. |
ния. С этой целью были выведены трансгенные |
У млекопитающих перенос генов осуществляется в |
свиньи, у которых в каскаде реакций комплемента |
основном путем микроинъекций в ядро яйцеклетки |
принимают участие некоторые факторы человека. |
или путем переноса эмбрионов, у домашней птицы – |
В первую очередь речь идет о hCD55 (фактор усиле- |
посредством рекомбинантных ретровирусов или оп- |
ния распада, DAF). Приматы, которым пересаживали |
лодотворения яйцеклеток сперматозоидами, несу- |
сердца трансгенных свиней с этим фактором, жили |
щими генные конструкции. Трансгенных рыб получа- |
до 40 дней, тогда как контрольные животные с серд- |
ют введением ДНК в яйцеклетки электропорацией. |
цами от нетрансгенных доноров погибали в течение |
В качестве примеров можно привести снижение вос- |
нескольких минут. |
приимчивости к болезням (например, ген устойчиво- |
|
сти к стрессу ryr1 у свиней) и усиление холодостой- |
|
кости за счет клонированного гена антифризного |
|
белка. |
|
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЕРМА. Ценные для медицины белки можно получать в молоке трансгенных животных. Для этого ген белка клонируют под контролем β- или αS1-казеинового промотора в ядре оплодотворенной яйцеклетки и переносят зиготу или выращенный ex vivo эмбрион в суррогатную мать. Выход трансгенных животных при таком подходе незначителен (< 0,1% использованных яйцеклеток), однако в случае успеха сразу получается трансгенное животное, синтезирующее необходимый белок (например, α1-антитрипсин, tPA, урокиназу, IGF-1, IL-2, лактоферрин или сывороточный альбумин человека) в количестве до 35 г/л молока. Продукт можно выделить из молока или употреблять непосредственно с молоком. Если считать, что одна дойная корова дает 10 000 л молока в год, то одной трансгенной коровы хватит, например, для того чтобы удовлетворить по-
170 требность системы здравоохранения США в факто-
Изменение свойств сельскохозяйственных животных
|
|
Мишень |
Свиньи |
Синдром злокачественной гипертермии: |
Рианодиновый рецептор, |
|
обмен Са в мышцах |
6-я хромосома Cysx → Arg |
Коровы |
κ-Казеин: качество молока |
Ген κ-казеина |
Лосось |
Антифризный белок: устойчивость |
Клонирование гена антифризного белка |
|
к экстремальным температурам |
камбалы |
|
|
|
Получение фармацевтических продуктов с использованием трансгенных животных
|
Выделение |
|
|
|
оплодотворенных |
|
|
|
эмбрионов |
Тестирование |
|
|
|
||
|
|
потомков |
|
|
|
на содержание |
|
ДНК |
|
гена целевого |
|
Микро- |
белка |
||
β-казеина |
инъекция |
редко |
|
коз |
вектора |
||
|
|||
|
в эмбрион |
|
|
|
|
часто |
|
Экспрес- |
Важные для |
Моло Молоко Молоко Молоко |
ДНК гена |
сирующий |
медицины белки |
|
|
|
||
вектор для |
|
|
|
целевого |
|
Рекомбинантный |
|
гена целевого |
|
||
белка |
|
белок в молоке |
|
белка |
|
||
|
|
|
Определение экспрессии
гена целевого белка
Индукция лактации
Селекция и разведение животных – основателей породы
Трансгенное стадо
|
Регуляторные |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
последовательности |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
ex1 ex2 |
h-tPA |
кДНК |
ex7 ex8 ex9 |
|
|||||||||
|
|
|
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ex1, 2, 7–9: экзоны генов β-казеина коз |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
h-tPA: активатор тканевого плазминогена человека |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Экспрессия важных для медицины белков в молоке трансгенных лабораторных животных
Генная конструкция |
Рекомбинантный белок |
Выход продукта, мг/л |
Трансгенное |
|
|
|
животное |
Кислый белок сыворотки |
tPA (кДНК) |
0–50 |
Коза |
Кислый белок сыворотки |
Белок С (кДНК) |
1 000 |
Свинья |
β-Лактоглобулин |
α1-Антитрипсин (геномный) |
35 000 |
Овца |
β-Лактоглобулин |
Сывороточный альбумин человека |
10 000 |
Мышь |
β-Казеин коз |
tPA (кДНК) |
3 000 |
Коза |
αS1-Казеин коров |
Урокиназа (геномная) |
2 000 |
Мышь |
αS1-Казеин коров |
Инсулиновый фактор роста (IFG-1) (кДНК) |
10 000 |
Кролик |
|
|
|
|
Использование трансгенных животных в производстве медицинских препаратов
Белок |
Потребность |
Объем плазмы |
Необходимое количество |
|
в белке в США, кг/год |
человека, л |
молочных коров с удоем 10 000 л/год |
|
|
|
|
Фактор VIII |
0,120 |
1 200 000 |
1,2 |
Белок С |
100 |
20 000 000 |
100 |
Фибриноген |
200 |
500 000 |
20 |
α1-Антитрипсин |
800 |
4 000 000 |
80 |
Сывороточный альбумин |
100 000 |
2 000 000 |
5 000 |
171
Биотехнология в сельском хозяйстве
172
Растениеводство
ВВЕДЕНИЕ. Вот уже около 11 000 лет – со времен |
растений. В Германии эта отрасль хозяйства прино- |
«революционного неолита» – люди культивируют рас- |
сит прибыль около 10 млрд евро в год. |
тения и пытаются повышать их урожайность различ- |
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО. Уже в древности люди замети- |
ными способами. В результате длительной селекции |
ли, что варварское отношение к лесам приводит к |
возникли современные культурные растения, которые |
вымиранию и опустошению местностей, однако и в |
отличаются от диких предков по количеству биомас- |
наши дни человек продолжает вырубать лес, в част- |
сы, продуктивности и количеству семян. Люди и до- |
ности во влажных тропиках. В 1800 г. в странах |
машние животные питаются преимущественно этими |
средней и северной Европы впервые стали приме- |
культурными растениями. Однако уже сегодня из |
нять практику устойчивого лесопользования (возраст |
6 млрд человек на Земле почти треть не получает |
вырубаемых елей – примерно 100 лет, дубов – при- |
полноценного питания. Если учесть прогнозируемое |
мерно 300 лет). Древесина (годовое производство |
удвоение населения Земли в последующие 50 лет, |
составляет 7 107 т) – ценное сырье в химической и |
становится очевидной необходимость увеличения ко- |
целлюлозно-бумажной промышленности, из нее по- |
личества выращиваемых растений. |
лучают также пиломатериалы, обрезную доску, ме- |
РАСТЕНИЕВОДСТВО. Успехи растениеводства оцени- |
бель и т.д. |
ваются по числу сортов различных растений с ти- |
СОВРЕМЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. |
пичными признаками, передающимися по наследст- |
Для получения стерильных мужских линий в растени- |
ву. Новый сорт растения возникает как результат |
еводстве можно использовать генетические методы, |
скрещивания и отбора. По способу размножения и |
например клонирование гена высокоактивной РНКазы |
оплодотворения, генетической структуре и составу |
из Вacillus amyloliquefaciens под контролем специфич- |
различают линейные, популяционные, синтетиче- |
ных для пыльцы промоторов, что приводит к засыха- |
ские, клонированные и гибридные сорта. Генетиче- |
нию пыльцы. Регуляция процесса осуществляется при |
ски гомогенные линейные сорта получаются при са- |
помощи Restorer-гена, продукт которого ингибирует |
моопылении растений, таких как пшеница, рис, |
РНКазы. Развитие методов получения каллусной, ме- |
ячмень или сахарный тростник. Большинство цве- |
ристемной, протопластной и гаплоидных культур и их |
тковых растений, например кукуруза, картофель, |
регенерации в целые ди- и гаплоидные организмы со- |
соя и сахарная свекла, перекрестноопыляемые, их |
вершило настоящую революцию в растениеводстве, |
популяции чаще всего представлены гетерозигот- |
значительно сократив затраты времени по сравнению |
ными линиями. Если допустить вегетативное раз- |
с классическими процедурами селекции. Трансгенные |
множение, например, картофеля или сахарного тро- |
растения могут экспрессировать факторы устойчиво- |
стника можно получить клонированный сорт с |
сти к вирусам, грибам, бактериям, гербицидам и ин- |
выровненным генотипом. Близкородственное скре- |
сектицидам, а также обладать различными полезны- |
щивание позволяет получать гомозиготные гибрид- |
ми или декоративными свойствами. Секвенирование |
ные сорта перекрестноопыляемых растений. Для |
геномов растений должно способствовать дальнейше- |
этого у таких растений, как кукуруза, удаляют муж- |
му развитию растениеводства. |
ские соцветия, однако для цветков, несущих и муж- |
|
ские и женские органы, это очень сложная опера- |
|
ция. Решить проблему поможет использование |
|
стерильных мужских линий растений, которые мож- |
|
но получить двумя способами: из растений с цито- |
|
плазматической мужской стерильностью (ЦМС, ко- |
|
дируется митохондриальным геномом) или при |
|
помощи самонесовместимых линий (СНЛ) – широко |
|
распространенного в природе способа избежать са- |
|
мооплодотворения. Гетерозиготные особи часто |
|
значительно сильнее гомозиготных, вероятно за |
|
счет того, что генные продукты обоих аллелей с |
|
меньшей вероятностью инактивируются или прояв- |
|
ляют большую реакционную способность. Это явле- |
|
ние (гетерозис) достигается в сельском хозяйстве |
|
путем возвратного скрещивания, так же как в слу- |
|
чае штаммов продуцентов антибиотиков. Аналогич- |
|
ные способы применяют в садоводстве: в настоя- |
|
щее время выведено около 11 000 сортов садовых |
|
Методы растениеводства |
|||
|
Классические |
Генно-инженерные |
|
Ресурсы |
Растения |
Растения, бактерии, |
|
|
грибы, вирусы |
||
|
|
||
|
Оценка исходного |
Идентификация |
|
|
растительного |
и выделение |
|
|
материала |
генов |
|
Вариации |
Скрещивание |
Перенос |
|
|
в растительные |
||
|
клетки |
||
2–4 года |
|||
|
|
Регенерация функцио- |
|
|
|
нального растения |
|
|
Селекция |
||
Селекция |
Внутренний тест |
||
|
8–11 лет |
||
Официальный тест |
|||
|
|||
|
|
Сорт |
|
Этапы выведения сортов |
Получение культурных растений (2000 г.)
Название |
Мировой |
|
|
|
урожай, |
|
|
млн т |
|
|
|
Тростниковый сахар |
Saccharum officinale |
1 260 |
Кукуруза |
Zea mays |
594 |
Рис |
Oryzae sativa |
594 |
Пшеница |
Triticum aestivum |
584 |
Лен |
Linum usitatissimum |
503 |
Картофель |
Solanum tuberosum |
321 |
Сахарная свекла |
Beta vulgaris |
246 |
Маниок |
Manihot esculenta |
175 |
Соевые бобы |
Glycine max |
161 |
Сладкий картофель |
Ipomoea batatas |
142 |
Ячмень |
Hordeum vulgare |
132 |
Томаты |
Lycopersicon esculentum 98 |
|
Виноград |
Vitis vinifera |
64 |
Сорго |
Andropogonoideae |
58 |
|
|
|
Однодольные |
|
|
Двудольные |
|
|
|
|
|
|
Генная инженерия |
|
|
||||||||||
(Самоопыление), |
|
(Цветковые растения, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
например пшеница, |
|
перекрестное опыление), |
|
|
|
|
Культивирование клеток |
|
|
|
||||||||||||
рис, ячмень, сахарный |
|
например кукуруза, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
тростник |
|
картофель, сахарная |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
ЦМС, СНЛ* |
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
свекла и соя |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Разведение гибридов |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Скрещивание и отбор |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Линейные сорта |
|
Гибридные сорта |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
1850 |
1900 |
1950 |
|
2000 |
|||||||||||||||||
(гомозиготы) |
|
(со значительной долей |
|
* ЦМС – цитоплазматическая мужская стерильность |
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
гомозигот) |
|
|
СНЛ – самонесовместимые линии |
|
|
|
Сравнение растительных геномов |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
Вид |
Число |
Плоидность |
Размер генома, |
|
|
|
|
|
|
|
хромосом |
|
1000 млн п. н. |
|
|
|
Однодольные |
|
|
|
|
|
|
|
|
Ячмень |
Hordeum vulgare |
7 |
2 |
4,8 |
|
|
|
|
Рис |
Oryza sativa |
12 |
2 |
0,42 |
|
|
|
|
Пшеница |
Triticum aestivum |
7 |
6 |
16 |
|
|
|
|
Кукуруза |
Zea mays |
10 |
2 |
2,5 |
|
|
|
|
Двудольные |
|
|
|
|
|
|
|
|
Резуховидка |
Arabidopsis thaliana |
5 |
2 |
0,1 |
|
|
|
|
Рапс |
Brassica napus |
19 |
2 |
1,23 |
|
|
|
|
Томат |
Lycopersicon exculentum |
12 |
2 |
1 |
|
|
|
|
Табак |
Nicotiana tabacum |
12 |
4 |
4,4 |
|
|
|
|
Картофель |
Solanum tuberosum |
12 |
4 |
1,8 |
|
173 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|