- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Ферментативное превращение сахаров
Ферменты |
ВВЕДЕНИЕ. Сахар в нашей пище представляет собой |
ПОЛУЧЕНИЕ. Глюкозоизомераза обнаружена во мно- |
D-сахарозу. В западноевропейских странах сахар на- |
гих микроорганизмах. Этот внутриклеточный фер- |
|
|
чали употреблять в пищу в XVIII в. Изначально его по- |
мент представляет собой гомодимер. В осуществле- |
|
лучали из сахарного тростника, произрастающего в |
нии каталитической реакции задействованы ионы |
|
тропических и субтропических зонах, но когда при |
Co2+, Mn2+ и Mg2+. На годовое производство в про- |
|
Наполеоне Европа оказалась в экономической блока- |
мышленных масштабах глюкозоизомеразы использу- |
|
де, была разработана технология производства саха- |
ют 1500 т стрептомицетов и Bacillus coagulans. Избе- |
|
ра из сахарной свеклы. Использование ферментов в |
жать дорогостоящей процедуры очистки фермента |
|
современных производственных процессах позволя- |
удается при использовании биореактора с иммобили- |
|
ет превращать большие объемы кукурузного и пше- |
зованными клетками штаммов-продуцентов глюкозо- |
|
ничного крахмала в глюкозо-фруктозный сироп |
изомеразы. В биореакторе с притоком воздуха весь |
|
(«изоглюкоза»). При рациональном питании (низко- |
процесс заканчивается за 72 ч. Смесь D-глюкозы и |
|
калорийный рацион, диета диабетиков, профилактика |
D-фруктозы, содержащая 42% D-фруктозы и назы- |
|
кариеса) часто используют различные сахарозамени- |
ваемая «изомеразой 42», образуется при 60 °С за |
|
тели. Для оценки сладости вещества проводят срав- |
30 мин. Биореактор имеет большое время эксплуата- |
|
нение с 10% раствором сахарозы. |
ции: «время полужизни» фермента при 60 °С – |
|
ИНВЕРТИРОВАННЫЙ САХАРНЫЙ СИРОП. Гидролиз |
50 сут. Модульная конструкция позволяет осуществ- |
|
сахарозы, катализируемый инвертазой, приводит к |
лять непрерывный процесс, в котором несколько био- |
|
образованию смеси равных количеств D-глюкозы и |
реакторов участвуют поочередно. В результате ген- |
|
D-фруктозы, называемой инвертированным сахаром. |
но-инженерной оптимизации штаммы-продуценты |
|
Такой сироп обладает той же сладостью, что и трост- |
глюкозоизомеразы, в отличие от природных штам- |
|
никовый сахар, и не кристаллизуется, поэтому его |
мов, не нуждаются в наличии кофактора Co2+. Про- |
|
широко используют в кондитерской промышленности |
дукт реакции содержит примеси карамелизованных |
|
при производстве конфет и пралине. Инвертазу вы- |
сахаров, которые удаляют с помощью активированно- |
|
деляют из клеток пекарских дрожжей Saccharomyces |
го угля. Фруктозный сироп поступает на предприятия |
|
cerevisiae. Фермент локализован в цитоплазме, поэ- |
пищевой промышленности в жидком виде. |
|
тому процедура его выделения относительно проста: |
D-ФРУКТОЗА обладает высоким показателем сладо- |
|
после разрушения клеток удается выделить чистый |
сти, ее получают из фруктозного сиропа или инвер- |
|
фермент. Технология получения инвертированного |
тированного сахара методом хроматографии. В клуб- |
|
сахара из 70% сахарозного сиропа основана на ис- |
нях топинамбура («земляной груши») содержится до |
|
пользовании иммобилизованной инвертазы в фер- |
75% инулина – полимера фруктозы. Гидролиз ину- |
|
ментативном реакторе. Реактор работает в непре- |
лина с образованием фруктозы катализирует фер- |
|
рывном режиме в оптимальных условиях в течение |
мент инулиназа. |
|
нескольких дней при 55 °С. |
|
|
ИЗОГЛЮКОЗА. Глюкозоизомераза, выделенная из |
|
|
стрептомицетов Actinoplanes или Bacillus coagulans, |
|
|
катализирует реакцию изомеризации D-глюкозы |
|
|
в D-фруктозу. В оптимальных условиях (60 °С) об- |
|
|
разуется сироп состава 42% D-фруктозы + 55% |
|
|
D-глюкозы, сладость которого совсем немного |
|
|
меньше, чем сладость сахарозного сиропа. Такой |
|
|
сироп получил название «изоглюкоза 42». После |
|
|
хроматографического выделения глюкозы и ее |
|
|
изомеризации получают сироп с содержанием фру- |
|
|
ктозы 55% (изоглюкоза 55). Этот продукт исполь- |
|
|
зуется для производства слабоалкогольных напит- |
|
|
ков. Изоглюкоза используется более чем в 40% |
|
|
всех напитков и блюд с добавлением сахара, при- |
|
|
чем более 80% предприятий расположены на тер- |
|
|
ритории Северной Америки. В странах ЕС, согласно |
|
|
межгосударственным соглашениям по регулирова- |
|
|
нию экономики, производится только 500 000 тонн |
|
90 |
фруктозных сиропов в год (менее 5% производимо- |
|
го свекловичного сахара). |
|
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ферменты и сахара |
|
|
|
|
|
|
D-Фруктоза |
|
D-Глюкоза |
|
Сахароза |
MR |
180,16 |
MR |
180,16 |
MR |
342,30 |
Тпл |
106 °С (Тразл.) |
Тпл |
146 °С (Тразл.) |
Тпл |
185–186 °С (Тразл. 165 °С) |
Продукты углеводного обмена |
|
|
|
Название |
Относительная |
Сырье, способ получения |
|
сладость |
|
|
(по сравнению |
|
|
с сахарозой)* |
|
Сахароза |
1,00 |
Сахарная свекла и сахарный тростник |
|
|
|
Глюкоза |
0,5–0,8 |
Гидролиз крахмала, катализируемый α-амилазой, |
|
|
глюкоамилазой |
Глюкозный сироп |
0,3–0,5 |
Гидролиз крахмала, катализируемый α-амилазой, |
|
|
глюкоамилазой |
Гидрированный |
0,3–0,8 |
Гидрирование гидролизатов крахмала |
глюкозный сироп |
|
|
Изоглюкоза 42 |
0,8–0,9 |
Ферментативная изомеризация глюкозы |
|
|
с глюкозоизомеразой |
Фруктоза |
1,1–1,7 |
• ферментативный гидролиз сахарозы |
•ферментативная изомеризация глюкозы
•ферментативный гидролиз инулина
с последующей хроматографической очисткой
|
Инвертированный сахар |
1,00 |
Гидролиз сахарозы с помощью инвертазы |
|
|
Маннит |
0,4–0,5 |
Гидрирование фруктозы |
|
|
|
|
|
|
|
Сорбит |
0,4–0,5 |
Гидрирование глюкозы |
|
|
|
|
|
|
|
Ксилит |
1,0 |
Гидрирование ксилозы |
|
|
Лактит |
0,3 |
Гидрирование лактозы |
|
|
|
|
|
|
|
Мальтит |
около 0,9 |
Гидрирование мальтозы |
Палатинит, изомальт |
0,45 |
Ферментативная изомеризация сахарозы с образованием |
||||
|
|
|
изомальтулозы (палатинозы), гидрирование смеси |
|||
|
|
|
глюкопиранозидсорбита и глюкопиранозидманнита |
|||
* Сладость оценивают на вкус по сравнению с 10% раствором сахарозы, поэтому этот показатель варьирует |
||||||
Получение |
|
|
|
|
|
|
Крахмал α-Амилаза, |
|
D-Глюкоза |
Глюкозо- |
D-Глюкоза + D-фруктоза |
Изоглюкоза |
|
глюкоамилаза |
|
изомераза |
42–55% фруктозы |
|
||
|
|
|
||||
|
|
|
|
Хроматографические |
|
|
|
|
|
|
методы |
D-Фруктоза |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
Сахароза |
Инвертаза |
D-Глюкоза + D-фруктоза |
Инвертированный |
|
|
|
|
50% + 50% |
сахар |
||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
||
Глюкозный |
|
Изомеризация |
Очистка |
Изоглюкоза 42 |
||
сироп |
55–65 °С, иммобилизованная |
Активированный уголь, ионообмен- |
42% |
|||
95–98% |
||||||
глюкозоизомераза |
|
ная хроматография, удаление воды |
фруктозы |
|||
декстрозы |
|
|||||
в колонном реакторе* |
|
|
||||
|
|
|
||||
|
|
|
|
Отделение глюкозы |
Изоглюкоза 55 |
|
* Каскад реакторов из нескольких колонн. |
|
Колоночная хроматография, |
55% |
|||
|
изомеризация |
фруктозы |
||||
Фермент активен более 50 сут. |
|
|||||
|
|
91 |
||||
|
|
|
|
|
Ферменты |
Утилизация целлюлозы и полиозы |
|
применяются в пищевой промышленности при приго- |
же из грибов Trichoderma reesei, Aspergillus niger, |
|
|
ВВЕДЕНИЕ. Целлюлазы и гемицеллюлазы широко |
ленные из бактерий Cellulomonas и Clostridium, а так- |
|
товлении пюре из овощей и фруктов. Кроме того, эти |
Humicola insolens. Получение целлюлаз в биореакто- |
|
ферменты используются в целлюлозно-бумажной |
ре проводится по стандартной методике выделения |
|
промышленности. Некоторые моющие средства так- |
внеклеточных ферментов. После отделения клеток и |
|
же имеют в своем составе щелочные целлюлазы (с |
осаждения белков ферментный препарат имеет по- |
|
целью размягчения целлюлозных волокон хлопчато- |
бочные активности, в частности гемицеллюлазную. |
|
бумажных тканей). Активно изучается возможность |
Для многих технологических процессов такие препа- |
|
использования целлюлаз и гемицеллюлаз для утили- |
раты имеют преимущество по сравнению с очищен- |
|
зации биомассы: образующиеся глюкоза и ксилоза |
ными ферментами. Производство гемицеллюлаз для |
|
могут служить питательными веществами при фер- |
переработки целлюлозы основано на использовании |
|
ментации с помощью микроорганизмов, например, |
белого плесневого гриба Тrichoderma reesei. Как пра- |
|
интенсивно вырабатывающих этанол. Однако на пра- |
вило, проводят поверхностную ферментацию или |
|
ктике такая технология пока не применяется. |
проточную ферментацию в биореакторе. В первом |
|
ЦЕЛЛЮЛОЗА – основной компонент клеточной стенки |
случае для обогащения фракции внеклеточных фер- |
|
растений, самое распространенное в органическом |
ментов осуществляют водную экстракцию коджи |
|
мире соединение. Волокна целлюлозы представляют |
(см. с. 6), а по окончании ферментации клетки отде- |
|
собой линейную последовательность молекул D-глю- |
ляют, а фермент извлекают из культуральной жидко- |
|
козы (около 10 000), соединенных между собой |
сти путем обработки этанолом. |
|
β-1,4-гликозидной связью. Между линейными цепя- |
ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗЫ. β-Глюканазы получают из Bacil- |
|
ми образуются водородные связи. Комплекс из |
lus subtilis, Penicillium emersonii, Aspergillus niger |
|
10–100 молекул называется элементарной фибрил- |
и других микроорганизмов, манназы и галактоманна- |
|
лой, микрофибриллы состоят из 20–30 таких фиб- |
зы – из Aspergillus niger и Trichoderma reesei по стан- |
|
рилл. |
дартной технологии выделения внеклеточных фер- |
|
ПОЛИОЗЫ (ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗЫ) – группа короткоце- |
ментов. |
|
почечных гетерополимеров, построенных из пентоз, |
ГЛЮКОЗА И КСИЛОЗА. Промышленные отходы, со- |
|
гексоз, дезоксигексоз и гексуроновой кислоты. Кле- |
держащие целлюлозу и полиозы (древесная стружка, |
|
точная стенка растений на 20% состоит из гемицел- |
багасса и др.), можно разлагать с образованием глю- |
|
люлоз. В зависимости от состава гемицеллюлозы де- |
козы и ксилозы, которые затем добавляют в пита- |
|
лятся на три типа: ксилоглюканы, арабиногалактаны и |
тельные среды для микробной ферментации. Эконо- |
|
пентозаны. Ксилоглюкан (ксилан) построен из остат- |
мические затраты на этот процесс складываются из |
|
ков глюкозы, соединенных β-1,4-гликозидной свя- |
расходов на транспортировку продукта, на подготовку |
|
зью. Разветвления цепей ксилоглюканов образованы |
субстрата, а также стоимости используемых фер- |
|
за счет β-1,6-связей с остатками ксилозы. Ксило- |
ментов. На первом этапе происходит разрушение |
|
глюканы связываются с микрофибриллами целлюло- |
лигнина термической обработкой или под действием |
|
зы через водородные мостики. Роль арабиногалакта- |
щелочи; при этом полиозы также частично |
|
нов, состоящих из арабинозных и галактозных остат- |
деградируют. Расходы на производство целлюлаз |
|
ков, соединенных β-1,4-связями, заключается в |
в рамках проекта США «Биомасса для этанола» в |
|
образовании связей с гликопротеинами, входящими |
2001 г. были снижены примерно на 80%. |
|
в состав клеточной стенки. Пентозаны построены из |
|
|
полимерных цепей арабинозы и ксилозы. |
|
|
БИОДЕГРАДАЦИЯ. В природе разложение целлюло- |
|
|
зы осуществляют бактерии и грибы. Среди послед- |
|
|
них особая роль принадлежит белым плесневым |
|
|
грибам, которые могут гидролизовать целлюлозу и |
|
|
полиозы, одновременно окисляя лигнин. В сложной |
|
|
реакции, в результате которой происходит разрых- |
|
|
ление волокон целлюлозы, принимают участие мно- |
|
|
жество ферментов. У некоторых организмов, напри- |
|
|
мер клостридий, эти ферменты организованы в |
|
|
целлюлосомы – белковые комплексы, находящиеся |
|
|
на поверхности клеток. |
|
92 |
ЦЕЛЛЮЛАЗЫ образуются во многих микроорганиз- |
|
мах. Наиболее хорошо изучены целлюлазы, выде- |
|
Полисахаридный состав клеточной стенки растений
Ксило- |
Микрофибриллы |
|
|
|
|
глюкан |
целлюлозы |
|
|
|
|
|
Арабинан + галактан |
|
|
Водо- |
|
|
|
|
|
|
|
Арабино- |
|
Участок, богатый |
родные |
|
|
|
гидроксипролином |
мостики |
|
||
галактуронан |
|
||||
|
|
|
|
||
|
|
Гликопротеин |
|
|
|
|
|
Рамногалактуронан |
|
|
|
Ксило- |
|
|
|
|
|
глюкан |
|
Микрофибриллы |
|
|
|
|
|
Микрофибриллы целлюлозы |
|||
|
|
целлюлозы |
|||
|
|
|
|
||
Компонент |
Состав |
|
Степень |
Состав |
Содержание |
|
|
|
полимеризации |
в клеточной |
|
|
|
|
|
|
стенке, % |
Целлюлоза |
β-1,4-D-Глюкоза |
|
1000–10 000, |
D-Глюкоза |
Древесина – 60*, |
|
|
|
микрофибриллы |
хлопок – 90 |
|
Пектин |
Полигалактуроновая кислота, |
100–2000 |
Галактуроновая кислота, 10–40 |
||
|
рамногалактуронаты, |
|
|
метиловые эфиры |
|
|
галактаны, арабиногалактаны |
|
галактуроновой кислоты, |
|
|
|
|
|
|
рамноза, арабиноза |
|
Полиозы |
Ксиланы, ксилогликаны, |
|
Ксилоза, глюкоза, |
20 |
|
(гемицеллюлозы) β-1,3- и -1,4-D-глюканы, |
|
галактоза, манноза |
|
||
|
галактоманнаны |
|
|
|
|
Другие |
Арабиногалактаны, |
|
|
Галактоза, арабиноза, |
|
полисахариды |
глюкурономаннаны |
|
|
глюкуроновая кислота, |
|
|
|
|
|
манноза |
|
* Древесина содержит 40% лигнина
Целлюлоза и ксилан
Целлюлоза
Мономер целлюлозы
Ксилоглюкан
Получение целлюлаз (пример)
Культура |
|
Поверхностная культура |
|
Выделение |
Выход |
|
|
|
|
|
продукта |
Рекомбинантный штамм- |
Переработка коджи |
|
Экстракция водой, |
||
|
10 000 ед. |
||||
суперпродуцент Trichoderma reesei |
3–5 сут |
|
осаждение этанолом |
||
|
за 100 ч |
||||
|
|
|
|
|
93