среда |
Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
окружающая |
ВВЕДЕНИЕ. В США, Канаде, Австралии и Мексике для |
веденных местах, куда руда транспортируется. В дру- |
|||||||||
|
|||||||||||
|
выщелачивания бедных руд (то есть для извлечения |
гом способе используют отработанные шахты. Хоро- |
|||||||||
|
отдельных составляющих руды путем их растворе- |
шо разработан метод чанового бактериального выще- |
|||||||||
|
ния) используются тиобактерии. Около 25% всего |
лачивания. Его преимущество по сравнению с |
|||||||||
|
мирового объема меди, более 10% золота и 3% ко- |
другими способами заключается в высокой эффек- |
|||||||||
|
бальта и никеля добываются с помощью биовыщела- |
тивности извлечения ценных металлов и экологиче- |
|||||||||
и |
чивания. |
ской безопасности процесса. Изучается также метод |
|||||||||
МИКРОБИОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ПРОЦЕССА. Тио- |
выщелачивания гетеротрофными микроорганизма- |
||||||||||
Биотехнология |
|||||||||||
бактерии осуществляют выщелачивание руд; эти хе- |
ми. В основе метода лежит секреция активных хела- |
||||||||||
|
|||||||||||
|
молитотрофные грамотрицательные палочки, как |
тирующих веществ (таких, как лимонная или глюко- |
|||||||||
|
правило, фиксируют СО2. Для получения энергии эти |
новая кислоты), например штаммами пеницилла, |
|||||||||
|
микроорганизмы окисляют восстановленные соеди- |
которым для роста требуются органические источни- |
|||||||||
|
нения серы, например сульфиды, в результате чего |
ки углерода. |
|
|
|
|
|
|
|||
|
образуется серная кислота. В отличие от Thiobacillus |
БИОКОРРОЗИЯ. В круговороте веществ в природе |
|||||||||
|
thiooxidans бактерии Т. ferroоxidans способны окис- |
один из важных процессов – анаэробное окисление |
|||||||||
|
лять не только восстановленные соединения серы, но |
металлического железа с образованием FeS (биокор- |
|||||||||
|
и растворимые соли Fe2+. Оба вида бактерий растут |
розия). Реакцию |
|
|
|
||||||
|
в кислой среде и устойчивы при рН 2. Сульфидные и |
|
|
|
2– |
|
+ 2H2O + 2Н+ → FeS + 3Fe(OH)2 |
||||
|
оксидные компоненты руды, такие как пирит (серный |
4Fe + SO4 |
|
||||||||
|
или железный колчедан, FeS2), халькозин (CuS2), |
осуществляют анаэробные микроорганизмы, способ- |
|||||||||
|
ковеллин (медный блеск, CuS), сфалерит (цинковая |
ные восстанавливать сульфат, например Desulfovib- |
|||||||||
|
обманка, ZnS), галенит (свинцовый блеск, PbS), мо- |
rio vulgaris. В анаэробных условиях железо также |
|||||||||
|
либденит (молибденовый блеск, MoS2), антимонит |
окисляется до Fe2+: |
|
|
|
||||||
|
(сурьмяный блеск, Sb2S3), сульфид кобальта (CoS) |
4Fe + 8H |
+ |
|
2+ |
+ 4H2 |
|||||
|
и уранинит (UO2) могут выщелачиваться посредст- |
|
→ 4Fe |
||||||||
|
Образующаяся в этом процессе водородная пленка |
||||||||||
|
вом тиобактерий. При прямом микробиологическом |
||||||||||
|
выщелачивании происходит непосредственный кон- |
защищает железо от |
дальнейшего разрушения. |
||||||||
|
такт между бактериями и сульфид-содержащим ми- |
В присутствии сульфата Desulfovibrio окисляет H2: |
|||||||||
|
нералом. Окисление до сульфата происходит в не- |
4H |
2 |
+ SO2– |
→ H S + 2H |
2 |
O + 2OH–, |
||||
|
сколько стадий согласно следующему суммарному |
|
|
4 |
|
2 |
|
|
|||
|
уравнению: |
что приводит к образованию нерастворимых сульфи- |
|||||||||
|
MS + 2O2 → MSO4 |
да железа и гидроксида железа: |
|||||||||
|
4Fe2+ + H2S + 2OH– + 4H2O → |
||||||||||
|
Непрямое бактериальное выщелачивание заключа- |
||||||||||
|
ется в химическом превращении сульфидсодержа- |
|
|
|
|
|
|
FeS + 3Fe(OH) + 6H+ |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
||
|
щих минералов в растворимые сульфаты и свобод- |
Биокоррозия существенно разрушает железные тру- |
|||||||||
|
ную серу: |
бы подземных коммуникаций. |
|
|
|||||||
|
MS + Fe2(SO4)3 → MSO4 + 2FeSO4 + S° |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Образующееся двухвалентное железо Fe2+ окисля- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ется бактериями до Fe3+ и снова может участвовать |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
в окислительном процессе в кислых условиях. При |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
рН 2–3 микробное окисление Fe2+ происходит в |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
105–106 раз эффективнее, чем химическое окисле- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ние. На практике два описанных способа выщелачи- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
вания руд часто проводят одновременно, так как ру- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ды имеют сложный состав. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ. Для процесса вы- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
щелачивания руд оптимальны следующие условия: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
руда подходящего состава с требуемым размером |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
частиц, проведение реакций в кислых условиях и при |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
температуре около 30 °С, интенсивная аэрация. На |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
120 |
практике выщелачивание руды проводят in situ непо- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
средственно на рудном отвале или в специально от- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Биологическое выщелачивание руды |
|
|
|
||||||||
Выщелачивание |
|
Вскрыша |
|
|
|
|
|||||
рудного отвала |
|
|
|
|
|
|
Добавление воды |
|
|||
Нетронутый |
|
|
|
|
Выщела- |
|
Анализ, |
|
|||
породный массив |
|
|
|
|
|
контроль |
|
||||
|
|
|
|
чивание |
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
процесса |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
Отвал, в который |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
внесены микро- |
|
|
|
|
|
|
Thiobacillus |
|
|
|
организмы |
|
|
|
|
Сульфид меди |
ferrooxidans |
Сульфат меди |
Кислота |
|
|||||||
Плавка |
|
|
|
|
|
|
|
|
Высу- |
Расплавление |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
Железный шлам |
Осаждение |
|
шива- |
|
||||
|
|
|
|
ние |
|
||||||
|
Fe° + Cu2+ |
Cu+ + Fe2+ |
|
|
Медный шлам |
Электролиз |
|||||
|
|
|
|
|
|
||||||
Стадии биохимического процесса |
|
|
|
|
|||||||
SO32– + АМФ |
|
АФС + 2е– |
|
|
|
|
|||||
АФС + P |
i |
|
АДФ + SO2– |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
АМФ |
АФС |
АДФ |
2АДФ |
|
|
АМФ + АТФ |
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
||||||
|
АМФ – аденозинмонофосфат |
|
|
|
Сульфидоксидаза |
AФС-редуктаза |
|
||||
|
АДФ – аденозиндифосфат |
|
|
|
Тиосульфатгидролаза |
Сульфатаденилилтрансфераза |
|||||
|
АФС – аденозинфосфосульфат |
|
|
|
Серная оксидаза |
Аденилаткиназа |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Сульфитоксидаза |
|
|
|
Кинетика выщелачивания |
|
|
|
|
Варианты осуществления выщелачивания |
||||||
|
100 |
|
|
|
|
T. ferrooxidans |
а |
|
Выщелачивание |
||
|
90 |
|
|
|
|
T. ferrooxidans + |
|
|
рудного отвала |
||
|
80 |
|
|
|
|
T. thiooxidans |
|
|
|
||
% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
70 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
урана, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Подача |
|
60 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
50 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Экстракция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Отвод |
|
40 |
|
|
|
|
|
T. thiooxidans |
|
|
|
||
30 |
|
|
|
|
|
|
|
Выщелачивание |
|||
|
|
|
|
|
|
|
б |
|
|||
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
складированного |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
шлама |
|
|
10 |
|
|
|
|
|
Стерильные |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
условия |
|
|
|
|
|
|
10 |
20 |
30 |
40 |
|
50 |
сут. |
|
|
|
Культуры в качалочных колбах, |
|
|
|
|
|
|
|
||||
5% урановой руды, зерна < 600 мм |
|
|
|
|
|
|
|||||
Биокоррозия |
|
|
|
|
|
|
в |
|
Выщелачивание |
||
Металлическое |
|
|
|
|
|
|
|
|
in situ |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
железо |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Desulfo- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
vibrio |
|
|
|
121
медицине |
Инсулин |
|
рующий уровень глюкозы крови. При лечении сахар- |
||
|
ВВЕДЕНИЕ. Инсулин – это пептидный гормон, регули- |
|
в |
ного диабета (Diabetes mellitus) инсулин незаменим. |
|
Биотехнология |
||
До 1985 г. инсулин получали из отходов мясной про- |
||
|
||
|
мышленности (поджелудочная железа крупного рога- |
|
|
того скота и свиней). Современная технология произ- |
|
|
водства инсулина основана на использовании |
|
|
рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Saccharo- |
|
|
myces cerevisiae. Объем рынка инсулина составляет |
|
|
около 8 тонн в год и оценивается в 5 млрд долларов |
|
|
США. |
|
|
DIABETES MELLITUS (сахарный диабет). Это заболева- |
|
|
ние вызвано нарушениями образования или секреции |
|
|
инсулина в кровь. Более распространен диабет II типа, |
|
|
при котором лечение заключается в дополнительной |
|
|
стимуляции синтеза гормона в организме. При диабе- |
|
|
те I типа образование собственного инсулина наруше- |
|
|
но из-за генетического дефекта, вирусной инфекции |
|
|
или аутоиммунного заболевания, и для поддержания |
|
|
нормального уровня глюкозы крови пациенту необхо- |
|
|
димы регулярные инъекции инсулина. В мире от диа- |
|
|
бета страдают 170 млн человек, из которых 60 млн |
|
|
больны диабетом I типа (в Германии ~400 000 паци- |
|
|
ентов с диабетом I типа). Более 2% населения инду- |
|
|
стриальных регионов Земли являются диабетиками II |
|
|
типа (в Германии – 2,4 млн). |
|
|
БИОСИНТЕЗ ИНСУЛИНА. Синтез препроинсулина про- |
|
|
исходит в β-клетках поджелудочной железы живот- |
|
|
ных. Образовавшийся в результате внутриклеточного |
|
|
процессинга проинсулин запасается в аппарате Голь- |
|
|
джи. При недостатке глюкозы в крови проинсулин |
|
|
расщепляется мембранными протеазами на три поли- |
|
|
пептидные цепи – А, В и С. Цепи А и В (21 и |
|
|
30 аминокислотных остатков соответственно) сближа- |
|
|
ются и соединяются посредством трех дисульфидных |
|
|
мостиков, а центральная С-цепь (31 аминокислотный |
|
|
остаток) под действием ферментов отщепляется. Так |
|
|
образуется активная форма инсулина. |
|
|
ПОЛУЧЕНИЕ ИНСУЛИНА. Возможность использова- |
|
|
ния инсулина при терапии диабета была продемонст- |
|
|
рирована в 1922 г. Традиционная методика получе- |
|
|
ния инсулина заключалась в экстракции бутанолом |
|
|
из поджелудочной железы крупного рогатого скота |
|
|
или свиней, последующей кристаллизации цинксо- |
|
|
держащей формы инсулина с дальнейшей очисткой |
|
|
гормона методами хроматографии. Количества инсу- |
|
|
лина, полученного из поджелудочной железы одной |
|
|
свиньи, хватает больному диабетом на 3 дня, а инсу- |
|
|
лина из одной коровы – на 10 дней. Однако свиной и |
|
|
коровий инсулин по аминокислотному составу отли- |
|
|
чаются от инсулина человека (в положениях 1 и 2 со- |
|
|
ответственно), поэтому при длительном приеме чу- |
|
122 |
жеродного инсулина у больных может развиваться |
|
иммунная реакция. Метод химического синтеза |
инсулина, полностью аналогичного человеческому, был предложен еще в 1964 г., однако осуществление в промышленном масштабе такого сложного и дорогостоящего синтеза оказалось экономически нецелесообразным. В 1975 г. был разработан метод получения из поджелудочной свиньи инсулина, полностью идентичного инсулину человеку. Для этого происходит ферментативное замещение остатка Ala30 в В-цепи на остаток Thr30 с помощью иммобилизованной карбоксипептидазы Y. Промышленное получение инсулина методами генетической инженерии стало возможным с 1985 г. В качестве клеток-хозяев, продуцирующих инсулин, были выбраны клетки Escherichia coli К12. Частота встречаемости кодонов аминокислот в клетках человека и бактерии значительно различается, поэтому, несмотря на то что кДНК препроинсулина можно выделить из культуры β-клеток человека (она составляет 75% фракции суммарной мРНК этих клеток), для создания экспрессирующего вектора более целесообразно оказалось получать кДНК методом химического синтеза. В ранних методах синтеза А- и В-цепи экспрессировали раздельно, очищали, а затем после химического окисления цистеина и образования дисульфидных мостиков получали активный инсулин. В современном производстве проинсулин в клетках Escherichia coli синтезируется в виде белка, слитого с триптофансинтазой, которую впоследствии отщепляют протеолизом. Такой проинсулинсодержащий слитый белок составляет до 40% клеточной массы оптимизированных штаммов-продуцентов, таким образом из 40 м3 клеточной культуры после очистки методом обращенно-фазовой хроматографии удается получить около 100 г чистого инсулина. Разработан способ получения укороченного, так называемого «мини-проин- сулина» в клетках Saccharomyces cerevisiae.
НОВЫЕ ТИПЫ ИНСУЛИНА. Было показано, что препарат инсулина человека, содержащего в В-цепи Lys28Pro29 вместо Pro28Lys29 значительно быстрее усваивается организмом, что помогает больным диабетом планировать свое питание. Такой лизпро-инсу- лин, как и обычную форму, получают в рекомбинантном штамме E. coli. В настоящее время изучаются возможности терапевтического применения других производных инсулина: Pro28Asp (инсулин аспарт – короткого действия, разрешен к применению), Asn3LysLys29Glu (В-цепь, инсулин глулизин – аналог инсулина быстрого действия, фаза III), Thr30Arg31Arg (В-цепь) Asn21Gly (А-цепь, инсулин гларгин – длительного действия), а также инсулина, содержащего Thr30delLys29, ацетилированного жирной кислотой (препарат «Инсулин Детемир»).
Первичная структура инсулина человека |
|
|
||
А-цепь |
|
|
|
|
В-цепь |
|
|
|
|
С-концевой Thr отщепляется карбоксипептидазой Y, а октапептид – трипсином |
||||
Пространственная структура |
Биосинтез инсулина и экспрессирующая плазмида |
|||
молекулы инсулина |
|
|
|
|
Структура инсулина |
Препосле- |
Препроинсулин |
Проинсулин = ВСА |
|
дователь- |
|
|
||
свиньи была |
|
ATG |
||
ность |
|
|||
установлена путем |
|
|||
Спонтанное |
кодирует |
|||
рентгено- |
||||
Met |
||||
стркутурного |
расщепление |
|
||
анализа моно- |
|
|
|
|
кристалла |
|
|
|
|
с разрешением |
|
|
|
|
0,18 нм (9INS) |
|
|
|
|
Коричневым |
Протео- |
Точка начала репликации |
||
цветом |
литическое |
Селективный маркер |
||
показана |
||||
расщепление |
Промотор |
|||
А-цепь, |
|
|
||
голубым – В-цепь, |
|
|
Препоследовательность Р |
|
желтым – дисульфидные мостики, |
|
|
с кодоном ATG |
|
красным – замена Ala30 (инсулин свиньи) |
|
Инсулин |
для расщепления |
|
на Thr30 (инсулин человека) |
|
с помощью BrCN |
||
|
|
|||
Структура инсулина из различных источников (С-конец В-цепи) |
|
|||
|
|
|
Трипсин |
|
|
|
|
Заменен С-концевой |
|
|
|
|
октапептид |
|
|
|
|
Карбоксипептидаза Y |
|
|
|
|
Заменен С-концевой остаток |
|
|
|
|
аланина на треонин |
|
Замена Lys |
Рекомбинант- |
Природный |
Инсулин |
Инсулин |
на Pro – |
ный инсулин |
инсулин |
свиньи |
крупного |
инсулин |
человека, |
человека |
|
рогатого |
с повышенной |
полученный |
|
|
скота* |
биологической |
в клетках |
|
|
|
активностью |
E. coli K12 |
|
* Дополнительные замены двух аминокислотных остатков в А-цепи |
|
Получение рекомбинантного инсулина человека в клетках E. coli K12 |
|
|||
Биореактор |
|
Выделение |
|
|
Обработка |
|
|
Объем 40 м3, |
Выделение телец |
1. |
Расщепление слитого белка по остатку метионина |
~ 2,5 г |
|||
30 ч, 37 °C, |
включения, |
|
с помощью CNBr |
инсулина |
|||
|
человека |
||||||
источник |
удаление |
2. |
Получение S-сульфопроизводных |
||||
на 1 м3 |
|||||||
углерода |
клеточных |
3. |
Восстановление S-сульфоцистеина до цистеина |
||||
за 30 ч |
|||||||
и источник |
фрагментов |
4. Образование дисульфидных мостиков (O2, рН 10,6) |
|||||
|
|||||||
азота |
|
|
5. |
Трипсин/карбоксипептидаза В, удаление С-пептида |
|
||
123