Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия..pdf
Скачиваний:
542
Добавлен:
30.05.2021
Размер:
9.07 Mб
Скачать

Биотехнология в медицине

148

Вакцины

ВВЕДЕНИЕ. При так называемой «пассивной иммуни-

тивируют формальдегидом или тепловой обработкой.

зации» в организме вырабатываются антитела к ви-

В связи с риском инфицирования все этапы произ-

русам, бактериям или токсинам. «Активная иммуни-

водства вакцин требуют строжайшего соблюдения

зация», то есть вакцинация, которая используется

техники безопасности. После получения новых пре-

человеком уже более 200 лет, является значительно

паратов вакцин следует стадия испытаний на экспе-

более эффективным способом стимуляции иммун-

риментальных животных.

ной системы. В ответ на введение вакцины в ор-

ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИН. Причиной столбня-

ганизме происходят следующие процессы: активиру-

ка является попадание в кровь нейротоксина, выра-

ются В-лимфоциты – продуценты антител; активиру-

батываемого бактериями Clostridium tetani. Для по-

ются Т-лимфоциты, которые обладают способностью

лучения этого токсина разработан специальный

уничтожать чужеродный антиген; образуются долго-

штамм-суперпродуцент токсина (штамм Харварда). В

живущие В- и Т-лимфоциты (клетки памяти), кото-

ферментере по окончании роста культуры клетки

рые быстро активизируются при следующей встрече

подвергаются автолизу, освобождаются от клеточных

с тем же антигеном. В качестве вакцины могут слу-

фрагментов фильтрованием, а токсин подвергают об-

жить инактивированные, либо ослабленные (аттенуи-

работке 0,5%-м формальдегидом в течение четырех

рованные) микроорганизмы, которые не являются

недель. Полученный белок называется токсоидом.

вирулентными, однако вызывают иммунную реакцию.

Его очищают диафильтрацией и высаливанием, для

Иммунный ответ вызывают не только целые клетки,

повышения иммуногенности осаждают на солях алю-

но и отдельные клеточные компоненты, например по-

миния, после чего проводят испытания на экспери-

лисахариды, а также токсичные белки (токсины). Для

ментальных животных. Вакцину против кори получа-

получения аттенуированных вирусов разработан це-

ют, заражая культуру клеток животных или человека

лый ряд специальных технологий. На протяжении

вирусом rubella с пониженной вирулентностью

многих лет вакцины применяются для профилактики

(штамм Эдмонтона). После лизиса клеток-хозяев из

таких заболеваний человека, как корь, дифтерия,

среды выделяют вирус, который затем лиофилизуют

столбняк, коклюш, туберкулез, холера и полиомиелит,

для получения препарата с длительным сроком хра-

а также ящур скота. К сожалению, существует множе-

нения.

ство заболеваний, против которых до сих пор не полу-

 

чено вакцин. К таким заболеваниям относятся многие

 

тропические болезни и СПИД. Кроме того, снова ста-

 

новится актуальной профилактика некоторых болез-

 

ней, которые уже считались побежденными, как, на-

 

пример, туберкулез. В значительной мере риск

 

заболевания туберкулезом обусловлен появлением

 

новых штаммов, обладающих устойчивостью к анти-

 

биотикам. Методы генетической инженерии позволя-

 

ют получать новые высокоэффективные вакцины.

 

ПОЛУЧЕНИЕ ВАКЦИН. Традиционные методы произ-

 

водства вакцин основаны на получении инактивиро-

 

ванных или ослабленных антигенов в форме, доступ-

 

ной для парентерального, внутримышечного или

 

перорального применения. В качестве вакцины ис-

 

пользуют, как правило, непатогенные штаммы, кото-

 

рые, однако, вызывают иммунный ответ. Для получе-

 

ния такой формы штамма клетки выращивают в

 

лабораторных условиях, а затем инактивируют, обра-

 

батывая формальдегидом или подвергая тепловой

 

обработке. Производство многих вакцин против мик-

 

роорганизмов или их токсинов осуществляется

 

путем ферментации в биореакторах. До 1970 г. для

 

культивирования вирусов использовали яйца кур,

 

а в качестве вакцины применяли белки вирусной обо-

 

лочки. По современной технологии культуры живот-

 

ных клеток в биореакторах заражают вирусом.

 

Затем выделенные из культуры клеток вирусы инак-

 

Основные типы вакцин

 

Возникновение эпидемий инфекционных заболеваний

Пассивная иммунизация

 

Заболевание

 

 

Количество

Количество

 

 

 

 

 

зарегистрированных

смертельных

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение антител

 

 

 

 

 

 

случаев заболевания,

исходов,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

млн/год

тыс./год

Активная иммунизация

 

Диарея

 

 

 

> 4000

> 400

Парентеральное или

 

Гельминты

 

 

 

> 2000

>200

 

Болезни

 

 

 

> 350

> 4000

Пероральное введение

 

 

 

 

 

дыхательных путей

 

 

 

– убитых патогенных

 

 

 

 

микроорганизмов

 

Малярия

 

 

 

> 300

> 1

– ослабленных патогенных

 

Шистосомоз

 

 

> 250

> 10

микроорганизмов

 

 

 

 

Корь (в тропических странах)

 

> 44

> 1000

– патоген-специфического

 

 

антигена

 

 

 

Болезнь Шагаса (южно-

 

> 25

– патоген-специфической ДНК

американский трипаносомоз)

 

 

 

В случае системных инфекций

Туберкулез

 

 

> 6

> 2000

В случае локальных инфекций

СПИД

 

 

 

> 5

> 150

Примеры часто используемых вакцин

 

 

 

 

 

 

Вакцина

Применение

Состав

 

 

 

 

 

 

BCG

 

Туберкулез

Содержит живые аттенуированные штаммы* Mycobacetrium bovis

 

Rubella

 

Корь

 

Содержит живые аттенуированные вирусы Rubella

 

 

Poliomyelitis

Полиомиелит

Содержит живые аттенуированные вирусы полиомиелита

 

Cholera

 

Холера

 

Содержит убитые клетки Vibrio cholerae

 

 

Typhus

 

Тиф

 

Содержит живые аттенуированные штаммы Salmonella typhimurium

 

Haemophilus

Менингит

 

Содержит полисахарид капсулы Haemophilus influenzae

 

 

MKS

 

Ящур

 

Содержит инактивированный формалином вирус ящура

 

* Аттенуированный штамм – невирулентный ослабленный штамм, который способен вызывать иммунный ответ

 

Прозводство противовирусной вакцины

 

 

 

 

 

Банк

 

Стартовая

Стартовая

Культура клеток,

 

Аттенуация или

Концентри-

клеток

 

культура 1

культура 2

ферментация

 

инактивация

рование

Штаммы

Аттенуированный

 

 

 

 

 

 

штамм

 

 

 

 

 

Изготовление

 

 

 

 

 

Проверка качества

Фильтро-

 

 

 

 

 

 

лекарственной

 

 

 

 

 

 

продукта

 

вание

 

 

 

 

 

 

 

формы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ферментация и выделение

 

 

 

 

 

 

 

Антибактериальные вакцины

 

 

Антивирусные вакцины

 

 

 

 

Биореактор

 

 

 

 

Получение

 

Культивирование патогенных бактерий,

 

Аттенуированные вирусы

 

например, в реакторе объемом 5000 л

 

 

в зародышах трансгенных кур

 

 

 

 

 

 

 

 

или в культуре животных клеток

 

 

 

Инактивация

 

 

 

 

 

 

Добавление формальдегида

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выделение и контроль качества продукта

 

Очистка хроматографическими методами. Тестирование на животных

 

 

 

Лиофилизованный, устойчивый при хранении токсоид

Лиофилизованная, устойчивая при хранении вакцина

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

149

медицине

Рекомбинантные вакцины

вают новые возможности для создания вакцин. На-

 

ВВЕДЕНИЕ. Методы генетической инженерии откры-

в

ряду с получением чистых препаратов техника

Биотехнология

рекомбинантных белков позволяет разрабатывать

 

 

совершенно новые концепции иммунизации, напри-

 

мер введение вакцины в клетку с помощью белков

 

оболочки непатогенных вирусов, экспрессия вакци-

 

ны в трансгенных растениях или в молочных желе-

 

зах трансгенных животных, а также иммунизация

 

путем трансфекции ДНК. В ветеринарии уже приме-

 

няются рекомбинантные вакцины для животных, и

 

уже допущена к применению рекомбинантная вакци-

 

на для профилактики гепатита В у человека, для

 

профилактики дифтерии и вакцинирования против

 

боррелиоза.

 

СТРАТЕГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ. Современные вакцины,

 

полученные с использованием методов генетической

 

инженерии, содержат, как правило, не целые клетки

 

возбудителя заболевания, а их компоненты, напри-

 

мер специфические поверхностные белки. Такой под-

 

ход, несомненно, предполагает знание иммуногенной

 

структуры патогена. Примером использования этого

 

подхода является создание рекомбинантной вакцины

 

против гепатита В. Гепатит В – эндемическое забо-

 

левание во многих странах азиатского региона.

В90% случаев заболевание проходит бессимптомно, но в 5% приводит к хроническим болезням печени. По оценкам, в мире почти 1 млрд носителей вируса гепатита В. Для получения рекомбинантной вакцины из плазмы инфицированных доноров выделили поверхностный антиген HBsAg вируса гепатита

Ви осуществили экспрессию в различных клеткаххозяевах: культурах E. coli клеток млекопитающих и S. cerevisiae, но предпочтительнее – в культуре пекарских дрожжей. Экспрессированный белок очищали хроматографическими методами. Иммунохроматографические методы с использованием антител к HBsAg хотя и дали хорошие результаты, но этот метод очень дорогостоящий. Другим направлением развития нового поколения вакцин является получение аттенуированных штаммов. Например, по такой технологии был создан новый штамм Vibrio cholerеae для иммунизации против холеры. Холерный токсин, ответственный за патогенный эффект, представляет собой гексамерный белок с аденилатциклазной активностью. Под действием этого токсина концентрация цАМФ в тонком кишечнике увеличивается, что влечет значительные потери организмом жидкости и электролитов. Клиническими проявлениями холеры являются диарея и обезвоживание организма. Методами генетической инженерии удалось получить штамм V. cholerae, в геноме которого делетирован участок, ответственный за аденилатциклазную актив-

150 ность энтеротоксина. Такой измененный энтероток-

син вызывает полноценный иммунный ответ, однако не является патогенным. «Векторные» вакцины – еще одна новая стратегия иммунизации. В качестве вакцины при таком подходе используется вирусная ДНК, модифицированная таким образом, что она больше не оказывает патогенного действия, однако вызывает иммунный ответ. Для доставки вирусной ДНК в клетки выбран вирус коровьей оспы (Vaccinia). Геном этого вируса хорошо изучен, а сам вирус инфицирует клетки с высокой эффективностью и не опасен для человека. В геном Vaccinia можно встраивать различные вирусные антигены и наблюдать иммунный ответ. Так, на экспериментальных животных было подтверждено действие такой системы с G-белком вируса бешенства, с поверхностным антигеном гепатита В, с NP- и HA-белками вируса гриппа и с различными гликопротеинами Нerpes simplex. Стратегия «векторных» вакцин, несомненно, является многообещающей, однако ее серьезный недостаток заключается в риске развития вирусной инфекции у грудных детей, а также у лиц с ослабленным иммунитетом.

ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ. Программы иммунизации, основанные на использовании трансгенных растений, больше всего обсуждаются в странах третьего мира. Такие «съедобные вакцины» поступают в организм пероральным путем, поэтому особое внимание уделяется тому, каким образом вакцина проходит через желудочно-кишечный тракт и насколько эффективен иммунный ответ клеток слизистой оболочки. Использование трансгенных растений для иммунизации не исключено в будущем, однако пока такой подход вызывает множество вопросов, в том числе касающихся условий созревания, хранения и переработки плодов трансгенных растений, несущих вакцину.

ДНК-ВАКЦИНЫ (ГЕННАЯ ИММУНИЗАЦИЯ). После инъекции ДНК, кодирующей поверхностный белок возбудителя малярии Plasmodium falcuparum, в селезенке мышей образовывались антитела к этому паразиту. Эксперименты на мышах по экспрессии фрагментов генома Mycobacterium tuberculosis подтвердили возникновение Т-клеточного иммунного ответа. Удалось также выделить гены, ответственные за возникновение такого иммунитета. В обоих случаях антиген-специфическую ДНК встраивали в плазмиды. В настоящее время ДНК-вакцины лишь начинают разрабатываться.

Примеры рекомбинантных вакцин

Паразиты Бактерии Вирусы

 

Антиген

Фаза испытания

Гепатит В

Поверхностный антиген

Допущена к применению

Простой герпес типа 2

Поверхностный антиген

Клинические испытания

Бешенство

Поверхностный антиген

Не допущена к применению

Желтая лихорадка

Поверхностный антиген

Доклинические испытания

СПИД

Поверхностный антиген

Клинические испытания

Различные стрептококки

Полисахариды, мембранные белки

Клинические испытания

Clostridium tetani

Столбнячный токсин

Не допущена к применению

Mycobacterium tuberculosis

Поверхностный антиген, ДНК*

Клинические испытания

Plasmodium falciparum/Малярия

ДНК*

Клинические испытания

Trypanosoma sp./Сонная болезнь

ДНК

Доклинические испытания

Schistosoma mansoni/Шистосомоз

ДНК

Доклинические испытания

* Прайм-буст иммунизация

Рекомбинантная «векторная» вакцина на основе вируса Vaccinia

Ген белка оболочки

Белок оболочки

вируса гепатита В

вируса гепатита В

Реком-

Введение

В-клетки

синтезируют

бинантная

в кровь

антитела

вакцина

 

 

(модифициро-

 

 

ванный вирус

 

 

Vaccinia)

 

 

 

 

Вирус Vaccinia

Антитела

против вируса

Vaccinia

Антитела против белка оболочки вируса гепатита В

«Пептидные» или ДНК-вакцины против белков вирусной оболочки

Получение

Внутримышечное введение

 

в биореакторе

В-клетки

 

 

синтезируют антитела

 

Инъекция, пероральное

 

или интраназальное введение

 

В-клетки

 

синтезируют антитела

Плазмида,

Рекомбинантный

несущая ген

белок вирусной

вирусной

оболочки

оболочки

 

 

При инфекции антитела

 

связываются с вирусом

Ферментация и выделение рекомбинантных вакцин против вируса гепатита В

 

Биореактор

Выделение

Вакцина

Рекомбинантный штамм S. cerevisiae,

Осаждение, ультрафильтрация,

против rHBAg

несущий плазмиду для экспрессии белка rHBAg

хроматография

 

Контроль качества продукта (отсутствие патогенной активности, изучение аллергенных свойств и т. д.)

 

 

151