Применение ферментов в промышленных технологиях

Ферменты

ВВЕДЕНИЕ. Ферменты чрезвычайно широко исполь-

вавшихся из-за наличия примесей в ферментном пре-

зуются в промышленных технологиях, например в

парате, обходится дешевле, чем если бы проводилась

производстве стиральных порошков, пищевых проду-

дополнительная очистка исходного фермента. При

ктов, бумаги, текстиля и кожаных изделий. Многие

оценке применимости ферментного препарата в про-

реакции химического синтеза в промышленности

мышленном процессе учитывают не только его биохи-

также протекают с участием ферментов, так как по

мические характеристики, но и производственные

сравнению с традиционными катализаторами фер-

традиции. Поэтому при поиске ферментных препара-

менты обладают большей специфичностью. Кроме

тов с улучшенными качествами действуют особые

того, в настоящее время, когда многие ферменты до-

критерии, так что не всегда более активный препарат

ступны в виде рекомбинантных белков, их использо-

выигрывает при сравнении с уже известным ранее и

вание становится экономически выгодным, чем и

используемым аналогом.

объясняется стремительное развитие методов фер-

ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ. Производство приме-

ментативного анализа для диагностики и контроля

няемых в промышленности ферментов контролиру-

качества пищевых продуктов. Гены многих фермен-

ется согласно «Правилам организации производства

тов клонированы, а методы белковой инженерии по-

и контроля качества» (Good Manufacturing Practice).

зволяют оптимизировать свойства белков с целью их

Ферменты, полученные или модифицированные ме-

аналитического или промышленного применения.

тодами генетической инженерии, чаще всего идут на

Как правило, из-за высоких цен на кофакторы в про-

производство стиральных порошков. Для продуктов с

мышленности «работают» ферменты, не требующие

ограниченным потребительским спросом затраты на

кофакторов: гидролазы, лиазы, изомеразы и некото-

сертификацию часто превышают прибыль от продажи

рые оксидоредуктазы.

рекомбинантного продукта, поэтому случаи сертифи-

С КАКОЙ ЦЕЛЬЮ ПРИМЕНЯЮТСЯ ФЕРМЕНТЫ? Во

кации таких продуктов относительно редки. Одно из

всех отраслях промышленности, когда необходимо

исключений – рекомбинантный химозин – фермент,

повысить качество продукции и снизить затраты на

использующийся в производстве сыра.

производство, могут быть использованы ферменты.

ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. Экономический эффект

Протеазы в составе стирального порошка удаляют

использования ферментативной технологии зависит

белковые загрязнения с волокон тканей эффектив-

от цены фермента и рыночной цены продукта. Одна

нее, чем любые другие компоненты современных мо-

тонна неочищенного и достаточно чистого фермента

ющих средств. При ферментативном расщеплении

может стоить от нескольких центов до нескольких

крахмала образуется значительно меньше побочных

долларов. За последние 10 лет объем рынка фер-

продуктов, чем при проведении кислотного гидроли-

ментов вырос на 50% и составляет около 1,8 млрд

за. При изготовлении фруктовых соков использова-

доллларов США.

ние ферментов позволяет значительно увеличить эф-

фективность переработки фруктов. В кожевенной

промышленности действие протеаз и коллагеназ по-

могает освободить шкуру животного от волос и других

«излишеств»; использование ферментов позволило

значительно улучшить условия труда работников это-

го весьма экологически грязного производства. Тра-

диционно для створаживания молока использовали

сычужный фермент (экстракт из сычуга крупного ро-

гатого скота). В современном сыроварении «работа-

ет» рекомбинантный сычужный фермент, что значи-

тельно сокращает длительность процесса и улучшает

санитарногигиенические условия производства. В от-

личие от высокоспецифичных аналитических реак-

ций, во всех этих биотехнологических процессах при-

нимает участие множество сложных, зачастую

недостаточно полно охарактеризованных соединений.

Из экономических соображений в промышленных

процессах, как правило, используют почти неочищен-

ные ферментные препараты, обладающие рядом до-

82

полнительных активностей. Часто процедура очистки

основного продукта от побочных продуктов, образо-

Область применения

Фермент(ы)

Источник (некоторые),

Доля на рынке

Назначение

из которого выделен

ферментов,

фермента

фермент

%

Производство стиральных

Протеазы

Bacillus licheniformis

40

1

порошков

Липазы

Aspergillus nidulans

Целлюлазы

Trichoderma reesei

Расщепление крахмала

α-Амилаза

Bacillus amyloliquefaciens

5

3, 4

Изомеризация глюкозы

Глюкозоизомераза

Streptomyces venezuelae

7

1, 3

Пивоварение*

Амилазы

Bacillus subtilis

5

3, 4

Переработка овощей

Целлюлазы

Aspergillus niger

7

3, 4, 5, 6

и фруктов, виноделие

Гемицеллюлазы

Пектиназы

Хлебопечение

α-Амилаза

Aspergillus oryzae

10

1, 3

Протеазы

Производство сыров

Протеазы

Сычужный фермент,

12

2

Химозин

Rhizomucor miehei,

Липазы

Saccharomyces cerevisiae

Силосование

Целлюлазы

Aspergillus niger

2

3

и производство кормов

Производство бумаги

α-Амилаза

Bacillus amyloliquefaciens

2

4

и текстильная промышленность

Кожевенная промышленность

Протеазы

Aspergillus oryzae

10

1, 7

* В Германии не используется

%

Ферменты в различных отраслях промышленности

Стиральные порошки

Страны ЕС и Япония

40

США

30

HFS*

Хлебо-

Производ-

Кожевенное

Продукты

Разложение

20

печение

ство сыра

производ-

из фруктов

крахмала

10

ство

и виноделие

0

* HFS (high fructose syrup) – сироп с высоким содержанием фруктозы («изоглюкоза»)

Применение

Цена

С какой целью применяют ферменты?

Получение крахмального

~ 2 долл. США/т крахмала

1

Повышение выхода продукта

клейстера

Осахаривание

3,5 долл. США/т крахмала

2

Улучшение вкусовых качеств

Изомеризация

6 долл. США/т крахмала

Получение «изоглюкозы»

6–7 долл. США/т крахмала

3

Более продуктивная

в США (1986)

переработка

Получение спирта (1984)

1 долл. США/т крахмала

Пивоварение

10 цент./100 л спирта

Хлебопечение США

5–10 цент./100 кг муки

4

Снижение затрат

на производство

Европа

5–50 цент./100 кг муки

Изготовление

5–10 цент./100 л сока

фруктовых соков

5

Улучшение фильтруемости

Виноделие

5–10 цент./100 л вина

Изготовление лимонадов

26–79 цент./1000 л

Производство сыров

5 цент./100 л молока

6

Консервирование продукта

Производство

4–6 цент./кг

стиральных порошков

стирального порошка

7

Снижение количества

Кожевенное

1,2–3 долл. США/т кожи

экологически вредных отходов

производство

Ферменты

Ферменты в производстве моющих средств

первый стиральный порошок с добавлением панкреа-

цесса не превышает 72 ч. Затем клеточную массу от-

ВВЕДЕНИЕ. Около 100 лет назад Отто Рём создал

под контролем этих промоторов. Длительность про-

тических ферментов; это моющее средство хорошо

деляют в специальных сепараторах или отфильт-

удаляло с тканей загрязнения белковой природы

ровывают (чаще всего используется мембранная

(пятна крови, какао, травы и др.). В 1960-е гг. после

технология); протеиназы (внеклеточные ферменты)

разработки технологии получения щелочных протеаз

очищают и концентрируют осаждением или ультра-

из штаммов Bacillus производство стиральных по-

фильтрацией. При попадании в дыхательные пути

рошков стало стремительно развиваться. Методами

протеиназы могут вызывать аллергические реакции,

белковой инженерии эти протеазы были усовершен-

поэтому их добавляют в стиральные порошки в виде

ствованы специально для использования в моющих

гранул. Для этого к концентрату фермента в высоко-

средствах. Мировое производство рекомбинантных

скоростном смесителе и экструдере добавляют соли,

протеаз из Bacillus превышает 1000 тонн в год. В со-

воск, стабилизаторы; при сушке в кипящем слое об-

став стиральных порошков и моющих средств для

разуются гранулы («капсулы»), покрытые воском и

посудомоечных машин могут входить и ферменты

пигментом. Согласно исследованиям, протеазы в та-

других классов – целлюлазы, липазы, амилазы, ге-

кой форме безопасны для здоровья и не вызывают

мицеллюлазы, манназы, пектат-лиазы, протеазы и

аллергических реакций.

амилазы.

ЦЕЛЛЮЛАЗЫ. При определенных рН целлюлазы

УДАЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ СТИРАЛЬ-

эндодействия катализируют гидролиз целлюлозы

НЫХ ПОРОШКОВ. Стиральные порошки содержат, как

хлопчатобумажных тканей. В результате ткань стано-

правило, анионные и неионные, а в некоторых случа-

вится более мягкой, а краски более яркими. Кроме

ях и катионные поверхностно-активные вещества

того, целлюлазы эффективны при удалении различ-

(ПАВ). В жесткой воде из-за взаимодейстия с иона-

ных пятен. В стиральные порошки добавляют цел-

ми Ca2+ и Mg2+ анионные ПАВ теряют активность и

люлазы из клеток Humicola insolens, Bacillus sp.,

выпадают в осадок, поэтому к стиральным порошкам

Melanocorpus sp. и Thielavia sp., клонированных в As-

добавляют смягчители, понижающие жесткость во-

pergillus oryzae или Bacillus subtilis.

ды. Ранее для смягчения воды использовался фос-

ЛИПАЗЫ. Эффективность липаз связана с тем, что,

фат натрия, а сейчас – натрий–алюминиевые соли

кроме расщепления триглицеринов, эти ферменты

кремниевой кислоты (силикаты), а также в неболь-

катализируют расщепление эфиров длинноцепочеч-

ших количествах органические лиганды-комплексо-

ных кислот, присутствующих в таких трудноудаляе-

образователи (лимонная кислота и фосфонат). В ка-

мых загрязнениях, как следы от губной помады.

честве отбеливателей добавляются перкарбонат

Чаще всего в стиральные порошки добавляют липазы

натрия и активаторы (например, тетраацетилэтилен-

из клеток Humicola insolens или рекомбинантных

диамин, ТАЭД) – при стирке образуются органиче-

штаммов Aspergillus oryzae.

ские пероксикислоты. Раствор стирального порошка

АМИЛАЗЫ. Амилазы удаляют крахмалсодержащие

имеет рН ~10,0, процесс стирки, как правило, зани-

загрязнения. В некоторые стиральные порошки и мо-

мает 30 мин при температуре от 30 до 90 °С, следо-

ющие средства добавляют термостабильные амила-

вательно, входящие в состав стирального порошка

зы, устойчивые в щелочных условиях. Их получают

ферменты должны быть устойчивы в щелочных усло-

из рекомбинантных штаммов Bacillus, в которых в ге-

виях и при повышенной температуре (вплоть до

не амилазы произведена замена некоторых остатков

60 °C), а также быть достаточно устойчивыми к дей-

метионина.

ствию комплексообразователей, окислителей и ПАВ.

Ферменты, входящие в состав стиральных порошков,

имеют низкую специфичность.

ПРОТЕАЗЫ. В стиральных порошках и моющих сред-

ствах используются исключительно сериновые про-

теиназы (субтилизины), выделенные из штаммов Ba-

cillus. Сегодня методами генетической инженерии

получены штаммы-суперпродуценты протеиназ. Пу-

тем направленного мутагенеза удалось получить про-

теиназы, устойчивые к действию комплексообразо-

вателей и окислителей. В ходе ферментации на

определенной стадии клеточного роста в среду доба-

84

вляют промотор-специфические индукторы, стимули-

рующие синтез протеиназ, гены которых находятся

Использование протеиназ в производстве стиральных порошков

Тип протеиназы

Сериновые

Цистеиновые

Карбокси-

Металло-

протеиназы

протеиназы

пептидазы

протеиназы

Пример

Субтилизин

Папаин

Пепсин

Термолизин

Активность при рН 10

+

–

–

–

Стабильность при рН 10

(+)

–

–

–

Стабильность при 50°С

+

_

_

+

Устойчивость против

+

+

+

–

комплексообразования

Устойчивость к окислению

+

–

+

+

Устойчивость к ПАВ

~

~

~

~

Структура

Вектор трансформации

Промотор протеиназы

Точка начала

Субтилизин

репликации (ori)

Терминатор

Селективный

маркер

Субтилизин Карлсберга (1scb) (разрешение 0,23 нм).

Каталитический центр (Ser, Asp, His) изображен

Плазмида для экспрессии субтилизина Карлсберга

красным цветом; зеленым цветом обозначен Met222

в штамме-суперпродуценте Bacillus lentus

Ферментация и получение

Предферментация

Генетически модифицированные

штаммы-суперпродуценты Bacillus lentus;

10 м3, 24 ч при 35 °С

Основной процесс

120 м3, 48 ч при 35 °С, источник углерода –

декстрин, источник азота – соевая мука;

добавление казеина как индуктора

Более 15 г/л субтилизина через 60 ч

1 см

Отделение клеток и концентрирование

Микрофильтрация и ультрафильтрация, осаждение

Гранулирование

Гранулирование

в смесителях

Мелкие твердые частички

Мелкие твердые частички

(соль/сахар),

(соль/ПЭГ),

ловушка радикалов,

гранулирование

высушивание,

в специальных смесителях,

гранулы покрыты

высушивание,

ПЭГ*/TiO2

гранулы покрыты ПЭГ/TiO2

1 см

* ПЭГ – полиэтиленгликоль

85