инженерии

Выключение генов

ВВЕДЕНИЕ. Направленное выключение генов являет-

ся важным инструментом для фундаментальных

генетической

исследований. Удаление нежелательных признаков

необходимо при выведении улучшенных сортов рас-

тений, в животноводстве, в медицине (например, при

противораковой терапии), а также при получении но-

вых штаммов микроорганизмов для биотехнологиче-

ского производства. Наряду с ненаправленным мута-

генезом в результате действия мутагенов или

Методы

облучения клеток существуют современные методы

генетической инженерии, позволяющие проводить

направленное выключение генов на уровне ДНК

(gene silencing, knock-out) или РНК (anti-sense RNA).

ВЫКЛЮЧЕНИЕ ГЕНОВ (KNOCK-OUT ) ПУТЕМ КЛОНИ-

РОВАНИЯ ДНК. Векторы для трансформации живот-

ных и растительных клеток, которые реплицируются

вне хромосомы, встречаются очень редко. Как прави-

ло, они встраиваются в хромосому в процессе

рекомбинации. Это свойство используется для выклю-

чения определенного гена: ДНК-вектор имеет участок,

частично гомологичный кодирующей области исследу-

емого гена, однако из-за мутации или делеции не ко-

дирующий полноценный белок. В результате рекомби-

нации ген с нарушенной экспрессией встраивается в

хромосому. Оптимальная длина вставки фрагмента

ДНК для осуществления рекомбинации составляет

около 150 п.н. Рекомбинация – процесс, протекающий

с низкой вероятностью (< 10–3), поэтому необходима

система селекции, аналогичная маркерному гену в

прокариотических клетках. В клетках млекопитающих

селективными маркерами часто служат гены, обеспе-

чивающие способность роста на средах с токсичными

веществами, например при экспрессии гена дигидро-

фолатредуктазы клетки выращивают на среде с мето-

трексатом.

«АНТИСМЫСЛОВАЯ» РНК – это РНК с последователь-

ностью, комплементарной специфической мРНК. Ген,

который необходимо выключить, встраивают в экспрес-

сирующий вектор в обратной ориентации, а затем полу-

ченную конструкцию используют для трансформации.

Образующаяся в результате транскрипции такого век-

тора мРНК (антисмысловая РНК, асРНК) комплемен-

тарна мРНК исходного гена, и из-за образования

дуплекса мРНК–асРНК синтез генного продукта пре-

кращается. Причина остановки трансляции, вероятно,

заключается в том, что этот дуплекс не может взаимо-

действовать с рибосомой. Другой причиной подавления

синтеза белка может быть быстрая деградация дуплек-

са под действием внутриклеточных рибонуклеаз.

Описанный метод выключения генов может иметь ин-

тересное приложение в медицине. Если причиной забо-

левания является нарушение в регуляции синтеза како-

248

го-то гена, выключение этого гена может оказаться

более эффективным, чем замена гена методами ген-

инженерии

РНК

ВВЕДЕНИЕ. В настоящее время считается почти дока-

занным, что геном на основе ДНК, генетическая ос-

генетической

нова современной биосферы, был производным про-

стейшей жизненной формы, у которой репликация

происходила при помощи РНК. И сегодня РНК играет

важную роль в жизнедеятельности клетки, находясь

в форме рибосомной, транспортной и информацион-

ной РНК. В биотехнологии РНК применяют для сле-

дующих целей: 1) для создания аптамеров (лигандов

Методы

с высоким сродством), 2) для биосинтеза токсичных

белков в условиях in vitro, 3) как вектор в генной те-

рапии и 4) как интерферирующая РНК при нокауте

генов.

АПТАМЕРЫ – это искусственно полученные фраг-

менты ДНК или РНК, которые обладают высоким

сродством к гидрофильным молекулам (белкам, ле-

карственным препаратам). Методом SELEX (система-

тическая эволюция лигандов при экспоненциальном

обогащении) проводят оценку способности к связыва-

нию целевых молекул среди обширной библиотеки

синтетических молекул ДНК или РНК (до 1014–1015

различных последовательностей). Наилучшие канди-

даты подлежат амплификации методом ПЦР–РВ и

транскрипции in vitro для получения дочерней библио-

теки с улучшенными свойствами. Аптамеры позво-

ляют добиться стабильного связывания даже в нано-

молярном диапазоне концентраций. Разработка

аптамеров для диагностических и терапевтических

целей преследует значительный коммерческий инте-

рес: аптамер-зондирование для протеомного анализа

(SomaLogic).

ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ СИНТЕЗ БЕЛКА. На матрице ДНК

синтез белков возможен и в неклеточных условиях.

Для этого требуется лизат E. coli, в котором содер-

жатся РНК-полимераза, различные тРНК, рибосомы

и аминокислоты. В присутствии АТФ удается полу-

чить до 1 мг белка за 24 часа. Этот метод коммерче-

ски доступен (ProteoMasterTM) и особенно подходит

для таких белков, гиперпродукция которых вредна

для клетки-хозяина (токсины, протеазы).

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ. Использование вирусных РНК-век-

торов в генной терапии описано в другом разделе.

Фракция мРНК из клеток опухоли человека успешно

используется для трансформации моноцитов пациен-

та. Их получают из зрелых дендритных клеток in vitro

уже содержащими специфичные для опухоли мРНК и

используют для стимулирования специфичных к опу-

холи цитотоксичных Т-лимфоцитов.

ИНТЕРФЕРИРУЮЩАЯ РНК (RNAI). Посттранскрип-

ционный сайленсинг генов стал известен в послед-

ние годы как важный механизм регуляции экспрес-

сии и формирования устойчивости к вредоносным

250

эндо- и экзогенным РНК (например, к РНК-вирусам).

Именно поэтому РНК-интерференцию называют «им-