Тенденции развития

272

Протеомика

ВВЕДЕНИЕ. Термин «протеомика», предложенный

в1995 г., отражает неразрывную связь между геномом и белковым составом клетки. Считается, что у высших организмов из одного генного транскрипта

врезультате сплайсинга и посттрансляционных изменений образуется примерно 10 белков. Протеомика занимается изучением экспрессии, функции и взаимодействия генных продуктов на основе анализа генома (функциональная геномика).

МЕТОДЫ. Основным методом протеомики является выделение и анализ большого числа белков. Например, протеом Escherichia coli состоит из 4000 белков. Решающее значение имеет способ выделения белка: так, мембранные и растворимые белки выделяют по-разному. В случае эукариотических организмов обычно используют экстракты из клеток различных тканей: так доказывают связь белкового состава клетки с ее тканевой принадлежностью. Наибольшее распространение для изучения характера экспрессии белков получил метод двумерного электрофореза,

вкотором в одном направлении происходит разделение белков в соответствии с их изоэлектрической точкой, а во втором – в сооветствии с молекулярной массой. При правильно подобранном диапазоне рН разрешение метода может быть достаточно высоким. Полуколичественную оценку результатов разделения в двумерном электрофорезе на ПААГ получают после окрашивания белков и сканирования геля с помощью специальных компьютерных программ. Самая совершенная система позволяет анализировать несколько сотен гелей в неделю. Особенно сложные задачи протеомики: идентификация белков, образующихся в очень малых количествах (10–1000 копий на клетку), количественная оценка содержания таких белков, установление взаимосвязи между геном и белком, подвергнутым значительным модификациям. Один из путей количественной оценки содержания белка известной структуры – использование библиотек антител. Однако часто перед исследователем стоит задача идентификации белка с неизвестной структурой. Современные технологии позволяют определить N-концевую (неацилированную) последовательность белка, если в пробе содержится более 1 мг белка. На следующем этапе проводят сравнение полученной концевой последовательности аминокислот (а с учетом вырожденности генетического кода – и участка гена) с геномной библиотекой. Для анализа многих белков, экспрессирующихся в небольших количествах, лучше всего подходит метод масс-спек- трометрии. Масс-спектрометрия MALDI-TOF (matrixassisted laser-desorption-ionization-time-of-light) позволяет определить молекулярную массу исследуемого белка лишь приблизительно. Для более точной информации о размере белка пробу в двумерном

электирофорезе на ПААГ обрабатывают трипсином и определяют массы полученных фрагментов белка. Сравнение полученных таким образом результатов с компьютерными данными по «виртуальной» обработке трипсином белков из библиотеки позволяет сделать выводы о молекулярной массе исследуемого белка. Очевидно, что такой метод можно использовать только в том случае, если геном организма, из которого выделен белок, полностью секвенирован и протеом достаточно хорошо охарактеризован. Если же подробная информация о структуре генома не доступна, используют масс-спектрометрию ESI-TOF (electrospray- time-of-light). Для этого создаются белковые маркеры PTS (protein sequence tags), помогающие идентифицировать неизученный белок с помощью белковых библиотек. Метод позволяет идентифицировать белок при содержании нескольких сотен фемтомолей, следовательно, надо чтобы он синтезировался в клетке в количестве сотен тысяч копий.

ПРИМЕНЕНИЕ. Методы протеомики позволяют изучать специфические для клетки или индуцированные внешними воздействиями изменения в характере экспрессии белков, например: 1) различия в экспрессии генов Escherichia coli при росте на глюкозе или на молочной кислоте; 2) экспрессия генов в β-клетках поджелудочной железы у здоровых людей и у больных диабетом; 3) токсическое действие лекарственных препаратов на экспрессию генов, например, в клетках печени. Таким способом часто удается найти «белковые маркеры» определенных заболеваний. Методы протеомики позволяют выяснить функцию белка в клетке. Для этого создаются протеомные карты клеток и моделируются «клеточные фабрики», учитывающие сложные взаимосвязи между белковыми комплексами. Для изучения функции белка в клетке полезным оказывается мечение с помощью tag-последовательности, которая позволяет проводить аффинную очистку белка для масс-спект- рометрии и окончательной идентификации.

Тенденции развития

Биоинформатика*