Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия..pdf
Скачиваний:
519
Добавлен:
30.05.2021
Размер:
9.07 Mб
Скачать

Основы биотехнологических методов

216

Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками

ВВЕДЕНИЕ. Из экономических соображений промышленное производство, как правило, основано на использовании иммобилизованных катализаторов. Выделенные ферменты включают в небольшие частицы или закрепляют на носителе. Если процедура очистки внутриклеточного фермента слишком трудоемкая, в реакторе иммобилизуют непосредственно клетки микроорганизма – продуцента фермента. Такие клетки обычно осуществляют несколько последовательных превращений.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ. Один из способов иммобилизации связан с применением ионообменных смол.

Вэтом случае клетки или ферменты связываются с носителем за счет адсорбции. Для иммобилизации клеток за счет ковалентных взаимодействий применяют три способа: 1) связывание с глутаровым диальдегидом, приводящее к образованию оснований Шиффа, и стабилизация путем восстановления боргидридом натрия; 2) иммобилизация на диизоцианатах; 3) фиксация на полимерных эпоксидных смолах (оксиранах). В качестве носителя используются разнообразные органические или неорганические материалы. Для иммобилизации ферментов также применяют глутаровый альдегид или диизоцианаты. Клетки или ферменты включают в полимерные гели, полученных при радикальных или фотохимических реакциях. Так, ферменты могут включаться в полиакриламидный гель в присутствии N, N'-метиленбисак- рил-амида после добавления персульфата калия.

Вкачестве примера полимеризации в результате фотохимической реакции можно привести образование полиуретана. При микрокапсулировании ферменты или клетки включаются в микрокапсулы в реакциях полимеризации на границе раздела водной и органической фаз. Часто для иммобилизации используют ионотропные гели, например альгинаты, которые полимеризуются в средах, содержащих ионы кальция.

Внастоящее время ведутся активные исследования возможностей включения биокатализаторов в состав искусственных волокон, например из производных целлюлозы.

но из важных преимуществ использования иммобилизованных биокатализаторов – их стабильность. В промышленном процессе срок службы иммобилизованных клеток или ферментов обычно составляет несколько месяцев (например, клетки, синтезирующие аспарагиновую кислоту, ферменты глюкозоизомераза или пенициллинацилаза).

ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ И ТЕХНОЛОГИЯ ПРОЦЕССА.

Основные типы ферментативных и клеточных биореакторов – трубчатые реакторы (с неподвижным слоем катализатора, с псевдоожиженным слоем катализатора, с неподвижным слоем катализатора и со струйным течением жидкости) и реакторы с перемешиванием (непрерывного или периодического действия). Наряду с усовершенствованием биокатализаторов (повышение их стабильности) и оптимизацией биореактора или ферментативного реактора (с учетом различных скоростей диффузии низко- и высокомолекулярных веществ) ведутся работы по выбору условий проведения реакции для максимального выхода продукта. К этим условиям относятся: подготовка исходных веществ, предотвращение побочных реакций и обработка продукта в зависимости от его применения. На производстве предпочтение отдано относительно простым операциям, которые можно контролировать и в случае необходимости регулировать. Для получения больших объемов продуктов, например фруктозных сиропов или 6-аминопеницилла- новой кислоты, обычно используют непрерывный технологический процесс, в ходе которого параллельно протекают несколько ферментативных реакций. Производство организовано таким образом, что модули, оснащенные биокатализаторами, могут подключаться поочередно, так что, когда ферментативная активность в одном модуле истощается, без остановки процесса включается другой модуль. Для производства небольшого количества продукта достаточно одного реактора.

СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ. Иммобилизованные биокатализаторы отличаются по своим свойствам от свободных ферментов или клеток: интенсивность процесса в случае иммобилизованных биокатализаторов определяется не только свойствами самого катализатора, но также процессами транспорта субстрата и продукта в направлении катализатора и от него. С целью оптимизации свойств иммобилизованных биокатализаторов предложены методы математического моделирования с учетом, кроме свойств фермента, других факторов, например размер частиц, на которых иммобилизован биокатализатор, и скорость транспорта веществ. Од-

Носители для иммобилизации

 

 

 

 

 

 

 

Неорганические носители

 

Природные и синтетические полимеры

Al2O3

 

Гели фосфата кальция

Активированный уголь

Оксираны

Коллаген

Бентонит

 

Пористые

 

Полиакриламид

 

Агароза

Полиамид

Пористое стекло

керамические

Карбоксиметилцеллюлоза

Альгинаты

Целлюлоза

материалы

 

Полиуретан

 

 

Декстран

 

 

 

 

 

 

 

 

Иммобилизация на поверхности стекла

 

 

 

 

 

 

 

Глутаровый диальдегид

 

 

 

 

 

 

 

Фермент с ε-аминогруппой лизина

Поверхность стекла

 

 

Типы реакторов

 

 

 

 

 

 

 

 

S = Субстрат

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Насос

P = Продукт

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

= Фермент

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Мембрана

Реактор с непод-

Реактор

 

Реактор

Реактор

 

 

 

 

 

вижным слоем

 

с неподвиж-

с псевдоожи-

с трехфазным

Мембранный реактор

 

биокатализатора

ным слоем

женным

псевдоожижен-

 

 

со струйным тече-

биокатали-

слоем био-

ным слоем

 

 

 

 

нием жидкости

 

затора

 

катализатора

 

 

 

 

 

 

Связь времени реакции и выхода продукта (ОВП)

 

 

 

 

 

Влияние размера частиц ср

Макс. плотность катализатора:

Влияние иммобилизации фермента

 

 

 

 

~10% объема

 

%

 

 

Свободный фермент

клетки биореактор ОВП, моль/(л ч)

100

 

 

 

Макс. значение

Превращение субстрата,

90

 

 

 

 

 

 

ОВП ограничено

 

 

1

 

 

 

скоростью

 

 

 

 

 

 

 

транспорта

 

 

 

 

 

 

 

 

веществ

 

 

Иммобилизованный

0,01

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

фермент

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0,0001

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Время

 

10–2

10–1

100

101

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Объемная доля катализатора, %

 

 

 

 

 

 

ОВП =

So – St

, моль/(л ч)

 

 

 

 

 

= Коэффициент использования

t

 

 

 

 

 

биокатализатора

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

So = Начальная концентрация субстрата, моль/л

 

 

 

= Время переработки субстрата свободным

 

 

 

(t) или иммобилизованным (t')

St = Концентрация субстрата в момент времени t, моль/л

 

 

биокатализатором

 

Влияние транспорта веществ

 

 

 

 

 

 

 

Внутренний транспорт: модуль Тиле ϕ

 

= Эффективный коэффициент диффузии, м2

 

Количество реагирующих веществ

 

= Коэффициент транспорта веществ, м/с

 

 

= Размер частиц, м

 

Количество диффундирующих веществ

 

 

 

= Коэффициент молекулярной диффузии, м2

 

 

 

 

 

 

 

= Максимальная концентрация катализатора

= Константа Михаэлиса

Внешний транспорт веществ: число Шервуда Sh

Массообмен

Диффузия

б/р

217

методов

Очистка биотехнологических продуктов

ВВЕДЕНИЕ. Образовавшийся в процессе фермента-

рушения клеток тельца включения отделяют центри-

биотехнологических

ции продукт может накапливаться внутри клетки

фугированием. В результате обработки телец вклю-

(если продукт является внутриклеточным ферментом

чения тиолами и мочевиной белок переводится в

 

 

или белком в составе телец включения) или выхо-

растворимое состояние, причем современные мето-

 

дить в культуральную среду. В традиционно применя-

дики позволяют сделать этот процесс обратимым.

 

емых для ферментации штаммах концентрация про-

При удалении мочевины диализом возможна ренату-

 

дукта обычно небольшая и составляет менее 10%, а

рация белка с образованием правильной системы ди-

 

часто даже менее 1% клеточного содержимого.

сульфидных связей. Дальнейшие этапы очистки вну-

 

Методы генетической инженерии позволяют значи-

триклеточных ферментов и ренатурированных из

 

тельно повышать выход продукта: в некоторых

телец включения белков аналогичны соответствую-

 

случаях этот показатель достигает 50%. После за-

щим этапам очистки внеклеточных продуктов.

Основы

вершения ферментации следуют стадии концентри-

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. После отделения кле-

рования и очистки полученного продукта. Выбор спо-

точной массы из культуральной жидкости осаждают

 

 

соба очистки зависит от целей использования

низкомолекулярные продукты, например аминокис-

 

продукта. Так, вещества, которые в дальнейшем бу-

лоты или лимонную кислоту. Процедура выделения и

 

дут применяться в фармакологии и при проведении

очистки антибиотиков включает несколько этапов

 

клинических анализов, подвергаются очень тщатель-

экстракции органическими растворителями (напри-

 

ной очистке, в то время как препараты ферментов

мер, н-бутилацетатом). Белки, в том числе и фер-

 

для технического использования часто содержат при-

менты, часто выделяют фильтрованием через мемб-

 

меси. Стоимость очистки продукта может составлять

раны. Для осаждения белка после фильтрования в

 

более 50% всех затрат на его производство, поэтому

раствор добавляют соли – сульфат аммония или на-

 

разработка усовершенствованных методов, позволя-

трия до высоких концентраций (высаливание). Для

 

ющих снизить расходы на очистку без потерь качест-

каждого белка характерна специфическая концентра-

 

ва продукта, имеет важное экономическое значение.

ция солей, достаточная для осаждения. Большинство

 

Особое внимание уделяется переработке отходов,

белков осаждаются при содержании соли 10–50%.

 

образовавшихся при выделении и очистке продукта

Другой способ выделения белка заключается в экс-

 

(например, клеточной массы).

тракции: для этого в раствор добавляют небольшое

 

КЛЕТОЧНАЯ МАССА. При производстве пекарских

количество (2–10%) охлажденного органического

 

дрожжей биотехнологическим продуктом является

растворителя, например 2-пропанола. Для техниче-

 

клеточная масса. Осажденные центрифугированием

ских целей ферменты используются в виде фильт-

 

клетки промывают и пропускают через ротационный

рата в жидком или высушенном виде.

 

вакуумный фильтр барабанного типа или пластинча-

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ. Одновременное вы-

 

тый фильтр. Полученный продукт в полусухом виде

деление нескольких продуктов в одном резервуаре

 

высушивают распылением. В последнем случае срок

позволило бы значительно сократить время процесса

 

хранения, например, дрожжей значительно увеличи-

и общую площадь производства. Однако на практике

 

вается. Для сбора клеток также используют фильтра-

такие возможности удается реализовать очень ред-

 

цию клеточной суспензии.

ко. Интересным примером является создание про-

 

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Для выделения вну-

мышленной установки, в которой объединены проце-

 

триклеточных продуктов клетки должны быть разру-

дуры отделения клеток и очистки продукта. В этой

 

шены. Разработано множество способов разрушения

установке клеточный бульон пропускают через не-

 

клеток, однако в промышленности наиболее распро-

сколько неподвижных слоев ионообменной смолы.

 

странены физические методы с использованием

Экстракция в двухфазной системе, состоящей из не-

 

шаровых мельниц или гомогенизаторов высокого

смешивающихся водных растворов солей или поли-

 

давления. Для разрушения клеточной стенки в мяг-

меров, – еще один перспективный метод выделения

 

ких условиях используют ферменты. В лабораторных

биотехнологических продуктов.

 

условиях клетки, как правило, разрушают ультразву-

 

 

ком или ферментативными методами (например,

 

 

клетки E. coli обычно обрабатывают лизоцимом

 

 

в присутствии неионных ПАВ). В зависимости от на-

 

 

личия сигнальной последовательности белки нахо-

 

 

дятся в цитоплазме или в периплазматическом про-

 

 

странстве. Рекомбинантный белок может оказаться в

 

218

составе телец включения за счет образования ано-

 

мальных дисульфидных связей. После мягкого раз-

 

Схема очистки биотехнологического продукта

Принципы разделения

 

 

 

 

 

Ферментация

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Микрофильтрация

Тканевой фильтр

Живот-

Расти-

Микро-

Размер

 

Ультрафильтрация

Молекулярные

ные

тельный

 

организмы

 

 

 

 

сита

 

клетки

материал

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гель-хроматография

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Измель-

 

Внутри-

 

Вне-

 

 

Осмос

 

 

 

 

 

 

 

Диффузия

 

 

 

 

 

 

 

чение

 

клеточные

клеточные

 

 

 

Диализ

 

 

 

 

 

 

 

ферменты

 

ферменты

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Электродиализ

 

 

 

 

Экстракция

Разрушение

Заряд

 

Ионообменная

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

клеток

 

 

 

 

хроматография

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Дистилляция

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Давление пара

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Растворимость

Экстракция растворителями,

 

 

 

Центрифугирование, фильтрация

осаждение, кристаллизация

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Поверхностные

 

 

 

Флотация

 

 

 

 

 

 

 

свойства

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Концентрирование

 

 

 

Ультрацентри-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

фугирование

 

 

 

 

 

 

Очистка

 

 

Плотность

 

 

Центрифугирование

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Центробежный

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

сепаратор

 

 

Высушивание

 

 

 

 

 

 

Седиментация

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Конечный продукт

 

10–4

10–3

10–2

10–1

100

101

102

103

 

 

 

 

Размер частиц, мкм

 

 

 

Фильтрация

 

 

 

 

 

Центрифугирование

 

 

 

Ротационный вакуумный фильтр

 

Вакуум

 

 

 

 

 

 

 

Направление

 

 

Салфетка фильтр-пресса

 

 

 

 

 

 

 

вращения

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

с наполнителем,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

осадок на фильтре

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Снятие осадка

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

с фильтра

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Фильтрат

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Отфильтро-

 

Трубчатая

Камерный

 

Тарельчатый

 

 

 

 

 

 

ванные

 

 

 

Раствор фермента

 

клетки

 

центрифуга

сепаратор

 

сепаратор

 

 

 

 

Вход

 

Выход

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Фильтрация

 

 

Фильтрация

 

 

Экстракция растворителями

 

 

в статическом режиме

 

в проточном режиме

 

 

 

 

Многоступенчатая экстракция в противотоке

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

4

 

 

Обогащенный

 

 

 

 

 

 

 

5

 

 

Исходный

растворитель

 

 

 

 

 

 

 

 

3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

раствор

 

 

 

Экстракт

 

 

 

 

1 Суспензия

3 Фильтрат

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

 

культуры

 

4 Концентрат

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Фильтр

 

5 Мембрана

 

 

 

 

Растворитель

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

 

Твердые частицы

 

Смешивание

Разделение

 

 

Использование мембран для выделения и очистки биотехнологических продуктов

 

 

 

 

Обратный осмос

Ультрафильтрация

 

 

 

Принцип

Транспорт за счет диффузии

Разделение молекул по размеру

 

 

 

Удерживаемые частицы

MR < 500–1000

MR > 1000

 

 

 

Осмотическое давление

0,8–10 мПа

Очень низкое

 

 

 

Рабочее давление

1–15 мПа

< 1 мПа

 

219