- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Основы биотехнологических методов
216
Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
ВВЕДЕНИЕ. Из экономических соображений промышленное производство, как правило, основано на использовании иммобилизованных катализаторов. Выделенные ферменты включают в небольшие частицы или закрепляют на носителе. Если процедура очистки внутриклеточного фермента слишком трудоемкая, в реакторе иммобилизуют непосредственно клетки микроорганизма – продуцента фермента. Такие клетки обычно осуществляют несколько последовательных превращений.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ. Один из способов иммобилизации связан с применением ионообменных смол.
Вэтом случае клетки или ферменты связываются с носителем за счет адсорбции. Для иммобилизации клеток за счет ковалентных взаимодействий применяют три способа: 1) связывание с глутаровым диальдегидом, приводящее к образованию оснований Шиффа, и стабилизация путем восстановления боргидридом натрия; 2) иммобилизация на диизоцианатах; 3) фиксация на полимерных эпоксидных смолах (оксиранах). В качестве носителя используются разнообразные органические или неорганические материалы. Для иммобилизации ферментов также применяют глутаровый альдегид или диизоцианаты. Клетки или ферменты включают в полимерные гели, полученных при радикальных или фотохимических реакциях. Так, ферменты могут включаться в полиакриламидный гель в присутствии N, N'-метиленбисак- рил-амида после добавления персульфата калия.
Вкачестве примера полимеризации в результате фотохимической реакции можно привести образование полиуретана. При микрокапсулировании ферменты или клетки включаются в микрокапсулы в реакциях полимеризации на границе раздела водной и органической фаз. Часто для иммобилизации используют ионотропные гели, например альгинаты, которые полимеризуются в средах, содержащих ионы кальция.
Внастоящее время ведутся активные исследования возможностей включения биокатализаторов в состав искусственных волокон, например из производных целлюлозы.
но из важных преимуществ использования иммобилизованных биокатализаторов – их стабильность. В промышленном процессе срок службы иммобилизованных клеток или ферментов обычно составляет несколько месяцев (например, клетки, синтезирующие аспарагиновую кислоту, ферменты глюкозоизомераза или пенициллинацилаза).
ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ И ТЕХНОЛОГИЯ ПРОЦЕССА.
Основные типы ферментативных и клеточных биореакторов – трубчатые реакторы (с неподвижным слоем катализатора, с псевдоожиженным слоем катализатора, с неподвижным слоем катализатора и со струйным течением жидкости) и реакторы с перемешиванием (непрерывного или периодического действия). Наряду с усовершенствованием биокатализаторов (повышение их стабильности) и оптимизацией биореактора или ферментативного реактора (с учетом различных скоростей диффузии низко- и высокомолекулярных веществ) ведутся работы по выбору условий проведения реакции для максимального выхода продукта. К этим условиям относятся: подготовка исходных веществ, предотвращение побочных реакций и обработка продукта в зависимости от его применения. На производстве предпочтение отдано относительно простым операциям, которые можно контролировать и в случае необходимости регулировать. Для получения больших объемов продуктов, например фруктозных сиропов или 6-аминопеницилла- новой кислоты, обычно используют непрерывный технологический процесс, в ходе которого параллельно протекают несколько ферментативных реакций. Производство организовано таким образом, что модули, оснащенные биокатализаторами, могут подключаться поочередно, так что, когда ферментативная активность в одном модуле истощается, без остановки процесса включается другой модуль. Для производства небольшого количества продукта достаточно одного реактора.
СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ. Иммобилизованные биокатализаторы отличаются по своим свойствам от свободных ферментов или клеток: интенсивность процесса в случае иммобилизованных биокатализаторов определяется не только свойствами самого катализатора, но также процессами транспорта субстрата и продукта в направлении катализатора и от него. С целью оптимизации свойств иммобилизованных биокатализаторов предложены методы математического моделирования с учетом, кроме свойств фермента, других факторов, например размер частиц, на которых иммобилизован биокатализатор, и скорость транспорта веществ. Од-
Носители для иммобилизации |
|
|
|
|
|
|
|||||
|
Неорганические носители |
|
Природные и синтетические полимеры |
||||||||
Al2O3 |
|
Гели фосфата кальция |
Активированный уголь |
Оксираны |
Коллаген |
||||||
Бентонит |
|
Пористые |
|
Полиакриламид |
|
Агароза |
Полиамид |
||||
Пористое стекло |
керамические |
Карбоксиметилцеллюлоза |
Альгинаты |
Целлюлоза |
|||||||
материалы |
|
Полиуретан |
|
|
Декстран |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Иммобилизация на поверхности стекла |
|
|
|
|
|
|
|||||
|
Глутаровый диальдегид |
|
|
|
|
|
|
|
|||
Фермент с ε-аминогруппой лизина |
Поверхность стекла |
|
|
||||||||
Типы реакторов |
|
|
|
|
|
|
|
|
S = Субстрат |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Насос |
P = Продукт |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
= Фермент |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Мембрана |
Реактор с непод- |
Реактор |
|
Реактор |
Реактор |
|
|
|
|
|
||
вижным слоем |
|
с неподвиж- |
с псевдоожи- |
с трехфазным |
Мембранный реактор |
|
|||||
биокатализатора |
ным слоем |
женным |
псевдоожижен- |
|
|
||||||
со струйным тече- |
биокатали- |
слоем био- |
ным слоем |
|
|
|
|
||||
нием жидкости |
|
затора |
|
катализатора |
|
|
|
|
|
|
|
Связь времени реакции и выхода продукта (ОВП) |
|
|
|
|
|
||||||
Влияние размера частиц ср |
Макс. плотность катализатора: |
Влияние иммобилизации фермента |
|||||||||
|
|
|
|
~10% объема |
|
% |
|
|
Свободный фермент |
||
клетки биореактор ОВП, моль/(л ч) |
100 |
|
|
|
Макс. значение |
Превращение субстрата, |
90 |
|
|
||
|
|
|
|
ОВП ограничено |
|
|
|||||
1 |
|
|
|
скоростью |
|
|
|
|
|||
|
|
|
транспорта |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
веществ |
|
|
Иммобилизованный |
||||
0,01 |
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
фермент |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
0,0001 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Время |
|
|
10–2 |
10–1 |
100 |
101 |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
Объемная доля катализатора, % |
|
|
|
|
|
|
||||
ОВП = |
So – St |
, моль/(л ч) |
|
|
|
|
|
= Коэффициент использования |
|||
t |
|
|
|
|
|
биокатализатора |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
So = Начальная концентрация субстрата, моль/л |
|
|
|
= Время переработки субстрата свободным |
|||||||
|
|
|
(t) или иммобилизованным (t') |
||||||||
St = Концентрация субстрата в момент времени t, моль/л |
|
|
биокатализатором |
|
|||||||
Влияние транспорта веществ |
|
|
|
|
|
|
|
||||
Внутренний транспорт: модуль Тиле ϕ |
|
= Эффективный коэффициент диффузии, м2/с |
|||||||||
|
Количество реагирующих веществ |
|
= Коэффициент транспорта веществ, м/с |
||||||||
|
|
= Размер частиц, м |
|
||||||||
Количество диффундирующих веществ |
|
|
|||||||||
|
= Коэффициент молекулярной диффузии, м2/с |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
= Максимальная концентрация катализатора
= Константа Михаэлиса
Внешний транспорт веществ: число Шервуда Sh
Массообмен
Диффузия
б/р
217
методов |
Очистка биотехнологических продуктов |
||
ВВЕДЕНИЕ. Образовавшийся в процессе фермента- |
рушения клеток тельца включения отделяют центри- |
||
биотехнологических |
ции продукт может накапливаться внутри клетки |
фугированием. В результате обработки телец вклю- |
|
(если продукт является внутриклеточным ферментом |
чения тиолами и мочевиной белок переводится в |
||
|
|||
|
или белком в составе телец включения) или выхо- |
растворимое состояние, причем современные мето- |
|
|
дить в культуральную среду. В традиционно применя- |
дики позволяют сделать этот процесс обратимым. |
|
|
емых для ферментации штаммах концентрация про- |
При удалении мочевины диализом возможна ренату- |
|
|
дукта обычно небольшая и составляет менее 10%, а |
рация белка с образованием правильной системы ди- |
|
|
часто даже менее 1% клеточного содержимого. |
сульфидных связей. Дальнейшие этапы очистки вну- |
|
|
Методы генетической инженерии позволяют значи- |
триклеточных ферментов и ренатурированных из |
|
|
тельно повышать выход продукта: в некоторых |
телец включения белков аналогичны соответствую- |
|
|
случаях этот показатель достигает 50%. После за- |
щим этапам очистки внеклеточных продуктов. |
|
Основы |
вершения ферментации следуют стадии концентри- |
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. После отделения кле- |
|
рования и очистки полученного продукта. Выбор спо- |
точной массы из культуральной жидкости осаждают |
||
|
|||
|
соба очистки зависит от целей использования |
низкомолекулярные продукты, например аминокис- |
|
|
продукта. Так, вещества, которые в дальнейшем бу- |
лоты или лимонную кислоту. Процедура выделения и |
|
|
дут применяться в фармакологии и при проведении |
очистки антибиотиков включает несколько этапов |
|
|
клинических анализов, подвергаются очень тщатель- |
экстракции органическими растворителями (напри- |
|
|
ной очистке, в то время как препараты ферментов |
мер, н-бутилацетатом). Белки, в том числе и фер- |
|
|
для технического использования часто содержат при- |
менты, часто выделяют фильтрованием через мемб- |
|
|
меси. Стоимость очистки продукта может составлять |
раны. Для осаждения белка после фильтрования в |
|
|
более 50% всех затрат на его производство, поэтому |
раствор добавляют соли – сульфат аммония или на- |
|
|
разработка усовершенствованных методов, позволя- |
трия до высоких концентраций (высаливание). Для |
|
|
ющих снизить расходы на очистку без потерь качест- |
каждого белка характерна специфическая концентра- |
|
|
ва продукта, имеет важное экономическое значение. |
ция солей, достаточная для осаждения. Большинство |
|
|
Особое внимание уделяется переработке отходов, |
белков осаждаются при содержании соли 10–50%. |
|
|
образовавшихся при выделении и очистке продукта |
Другой способ выделения белка заключается в экс- |
|
|
(например, клеточной массы). |
тракции: для этого в раствор добавляют небольшое |
|
|
КЛЕТОЧНАЯ МАССА. При производстве пекарских |
количество (2–10%) охлажденного органического |
|
|
дрожжей биотехнологическим продуктом является |
растворителя, например 2-пропанола. Для техниче- |
|
|
клеточная масса. Осажденные центрифугированием |
ских целей ферменты используются в виде фильт- |
|
|
клетки промывают и пропускают через ротационный |
рата в жидком или высушенном виде. |
|
|
вакуумный фильтр барабанного типа или пластинча- |
КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ. Одновременное вы- |
|
|
тый фильтр. Полученный продукт в полусухом виде |
деление нескольких продуктов в одном резервуаре |
|
|
высушивают распылением. В последнем случае срок |
позволило бы значительно сократить время процесса |
|
|
хранения, например, дрожжей значительно увеличи- |
и общую площадь производства. Однако на практике |
|
|
вается. Для сбора клеток также используют фильтра- |
такие возможности удается реализовать очень ред- |
|
|
цию клеточной суспензии. |
ко. Интересным примером является создание про- |
|
|
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Для выделения вну- |
мышленной установки, в которой объединены проце- |
|
|
триклеточных продуктов клетки должны быть разру- |
дуры отделения клеток и очистки продукта. В этой |
|
|
шены. Разработано множество способов разрушения |
установке клеточный бульон пропускают через не- |
|
|
клеток, однако в промышленности наиболее распро- |
сколько неподвижных слоев ионообменной смолы. |
|
|
странены физические методы с использованием |
Экстракция в двухфазной системе, состоящей из не- |
|
|
шаровых мельниц или гомогенизаторов высокого |
смешивающихся водных растворов солей или поли- |
|
|
давления. Для разрушения клеточной стенки в мяг- |
меров, – еще один перспективный метод выделения |
|
|
ких условиях используют ферменты. В лабораторных |
биотехнологических продуктов. |
|
|
условиях клетки, как правило, разрушают ультразву- |
|
|
|
ком или ферментативными методами (например, |
|
|
|
клетки E. coli обычно обрабатывают лизоцимом |
|
|
|
в присутствии неионных ПАВ). В зависимости от на- |
|
|
|
личия сигнальной последовательности белки нахо- |
|
|
|
дятся в цитоплазме или в периплазматическом про- |
|
|
|
странстве. Рекомбинантный белок может оказаться в |
|
|
218 |
составе телец включения за счет образования ано- |
|
|
мальных дисульфидных связей. После мягкого раз- |
|
Схема очистки биотехнологического продукта |
Принципы разделения |
|
|
|
|||||||||
|
|
Ферментация |
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Микрофильтрация |
Тканевой фильтр |
|||
Живот- |
Расти- |
Микро- |
Размер |
|
Ультрафильтрация |
Молекулярные |
|||||||
ные |
тельный |
|
|||||||||||
организмы |
|
|
|
|
сита |
|
|||||||
клетки |
материал |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Гель-хроматография |
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Измель- |
|
Внутри- |
|
Вне- |
|
|
Осмос |
|
|
|
|
|
|
|
|
Диффузия |
|
|
|
|
|
|
|
||||
чение |
|
клеточные |
клеточные |
|
|
|
Диализ |
|
|
|
|
|
|
|
|
ферменты |
|
ферменты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Электродиализ |
|
|
|
|
||
Экстракция |
Разрушение |
Заряд |
|
Ионообменная |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
клеток |
|
|
|
|
хроматография |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
Дистилляция |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
Давление пара |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
Растворимость |
Экстракция растворителями, |
|
|
|
||||
Центрифугирование, фильтрация |
осаждение, кристаллизация |
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
Поверхностные |
|
|
|
Флотация |
|
|
||
|
|
|
|
|
свойства |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Концентрирование |
|
|
|
Ультрацентри- |
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
фугирование |
|
|
|
|
|
|
|
Очистка |
|
|
Плотность |
|
|
Центрифугирование |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Центробежный |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
сепаратор |
|
|
|
Высушивание |
|
|
|
|
|
|
Седиментация |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
Конечный продукт |
|
10–4 |
10–3 |
10–2 |
10–1 |
100 |
101 |
102 |
103 |
|||
|
|
|
|
Размер частиц, мкм |
|
|
|
||||||
Фильтрация |
|
|
|
|
|
Центрифугирование |
|
|
|
||||
Ротационный вакуумный фильтр |
|
Вакуум |
|
|
|
|
|
|
|
||||
Направление |
|
|
Салфетка фильтр-пресса |
|
|
|
|
|
|
|
|||
вращения |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
с наполнителем, |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
осадок на фильтре |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Снятие осадка |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
с фильтра |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
Фильтрат |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Отфильтро- |
|
Трубчатая |
Камерный |
|
Тарельчатый |
||
|
|
|
|
|
|
ванные |
|
|
|||||
|
Раствор фермента |
|
клетки |
|
центрифуга |
сепаратор |
|
сепаратор |
|||||
|
|
|
|
Вход |
|
Выход |
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Фильтрация |
|
|
Фильтрация |
|
|
Экстракция растворителями |
|
|
|||||
в статическом режиме |
|
в проточном режиме |
|
|
|
||||||||
|
Многоступенчатая экстракция в противотоке |
||||||||||||
1 |
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
1 |
|
4 |
|
|
Обогащенный |
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
Исходный |
растворитель |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
раствор |
|
|
|
Экстракт |
|||
|
|
|
|
1 Суспензия |
3 Фильтрат |
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
2 |
|
культуры |
|
4 Концентрат |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 Фильтр |
|
5 Мембрана |
|
|
|
|
Растворитель |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
3 |
|
Твердые частицы |
|
Смешивание |
Разделение |
|
|
||||
Использование мембран для выделения и очистки биотехнологических продуктов |
|
|
|
|
Обратный осмос |
Ультрафильтрация |
|
|
|
Принцип |
Транспорт за счет диффузии |
Разделение молекул по размеру |
|
|
|
Удерживаемые частицы |
MR < 500–1000 |
MR > 1000 |
|
|
|
Осмотическое давление |
0,8–10 мПа |
Очень низкое |
|
|
|
Рабочее давление |
1–15 мПа |
< 1 мПа |
|
219 |
|
|
|
|
|