Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия..pdf
Скачиваний:
538
Добавлен:
30.05.2021
Размер:
9.07 Mб
Скачать

аминокислоты

Этиловый спирт

ВВЕДЕНИЕ. Этиловый спирт (этанол) используется как

 

 

сырье в химическом производстве, как растворитель, а

 

также как топливо. В 2004 г. мировое производство эта-

 

нола составило 45 млрд л (34,6 млн т), из которых

и

лишь 2,3 млрд л были получены из этилена – продукта

переработки нефти и природного газа. Более двух

кислоты

третей этанола, поступающего на рынок, получают из

 

 

глюкозы биотехнологическими методами с помощью

 

анаэробных дрожжей и бактерий. Традиционная техно-

Спирты,

логия производства этанола использовалась во многих

нефть все чаще обращают вниимание на биотехнологи-

 

странах, затем стало экономически выгоднее получать

 

этанол из продуктов переработки нефти. В последние

 

годы в связи со значительным ростом мировых цен на

 

ческие подходы как резервную стратегию. Брожение мо-

 

жет снова стать основным способом промышленного по-

 

лучения этанола лишь при условии очень низких цен на

 

биомассу или слишком высоких цен на энергоносители.

 

С 1975 г. в Бразилии и США этанол используют в каче-

 

стве топлива для двигателей внутренного сгорания.

 

МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Для получения

 

этанола путем спиртового брожения самое важное

 

значение имеют пекарские дрожжи Saccharomyces

 

cerevisiae. При гликолизе 1 моль D-глюкозы дает

 

2 моль этанола. В бактериях Zymomonas mobilis,

 

выделенных из сока агавы, этанол образуется в кето-

 

дезоксифосфоглюконатном пути (пути Энтнера–Дудо-

 

рова). Оба этих микроорганизма не имеют ферментов

 

для расщепления полисахаридов, поэтому перед тем,

 

как добавлять в питательную среду углеводы, их рас-

 

щепляют до моносахаридов подходящими фермен-

 

тами. Другой биотехнологический метод получения

 

этанола основан на применении рекомбинантных

 

штаммов-суперпродуцентов, которые в результате

 

клонирования новых генов приобретают способность

 

перерабатывать такие дешевые виды сырья, как крах-

 

мал, целлюлоза или гемицеллюлоза. Особый интерес

 

представляют термофильные анаэробные бактерии

 

Thermoanaerobacter ethanolicus, которые могут рас-

 

щеплять многие углеводы. Оптимальные условия для

 

роста этого микроорганизма – температура 69 °С,

 

рН среды 4,5–9,5.

 

ПЕРЕРАБОТКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТАЦИИ.

 

В основе промышленной технологии получения этанола

 

лежит процесс брожения, который осуществляется в

 

биореакторах объемом до 500 м3 в периодическом ре-

 

жиме. В стандартных асептических условиях клетки

 

дрожжей Saccharomyces cerevisiae менее подвержены

 

заражению молочнокислыми бактериями, чем Zymomo-

 

nas mobilis. В качестве бактериальной культуры исполь-

 

зуют дрожжи, выращенные на обогащенной сахарами

 

среде. Через 14–20 ч выход этанола достигает макси-

20

мума (~90% теоретического значения). Процесс обра-

зования этанола замедляется из-за подавления роста

клеток дрожжей катаболитами. При концентрации глюкозы >0,1%, поэтому в промышленном процессе этанола применяют специальные методы контроля концентрации глюкозы в среде («fed-batch»). Другой причиной замедления роста дрожжей может быть высокая концентрация этанола, поэтому из культуральной среды следует непрерывно удалять этанол (через 72 ч его концентрация достигает 8% об.) путем азеотропной перегонки. При этом получают 95%-й этанол, который годится в качестве топлива. Абсолютный (100%) этанол получают путем специальных методов дистилляции, фильтрации через молекулярные или мембранные фильтры. При повторном использовании культуры время ферментации сокращается, например, по методу Мелле-Войно дрожжевые клетки концентрируют центрифугированием, полученной суспензией засевают другой биореактор. Промышленная технология может быть усовершенствована, если будет разработана непрерывная технология брожения. Теоретически такой процесс возможен, однако его практическое воплощение связано с преодолением больших технических проблем. Перспективно использование иммобилизованных дрожжевых и бактериальных клеток.

ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. Основным сырьем для производства этанола являются меласса из сахарной свеклы (Бразилия) или кукурузный крахмал (США). В мире насчитывается более 700 крупных фирм, производящих этанол путем ферментации в периодическом режиме. С 1975 г. в Бразилии осуществляется масштабное производство этилового спирта из мелассы по простой технологии (периодическая ферментация, дистилляция). Эту технологию применяют более 100 крупных производителей этанола; в настоящее время производство этилового спирта в Бразилии достигло 12 млрд л в год. В США с 1975 г. на некоторых автозаправочных станциях продают автомобильное топливо – смесь этанола (9:1; так называемый «газохол»). В США производство этанола с использованием осахаренного кукурузного крахмала в качестве питательной среды для роста дрожжей осуществляется с применением более сложных технологий (ферментация в периодическом режиме, мембранная очистка) и достигло 10,6 млрд л в год (2003). В Бразилии и в США отходы промышленного получения этанола используются как кормовые добавки. В Японии разработана экономичная технология с несколькими вариантами непрерывного технологического процесса, где применяются иммобилизованные клетки дрожжей. В экспериментальной установке, работающей в непрерывном режиме, за 200 суток был получен 10%-й этанол, который очищали на мембранных фильтрах.

Этанол

 

 

 

 

С2Н6О

 

 

 

Н3С—СН2—ОН

MR

46,07

Ткип

78,32 °С

Промышленное получение:

 

D.

0,79367 (15 °С)

Код CAS*

64-17-5

в основном гидратацией этилена

* Регистрационный номер Chemical Abstract Service. – Прим. ред.

 

Получение из мелассы

 

 

Охлаждение

 

 

Воздух*

 

 

 

 

СО2 + воздух

 

 

 

Питательные

 

S. cerevisiae

Резервуар

 

вещества,

 

 

Центрифуга

Меласса вода

 

 

для этанола

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Сепара-

Вакуумная

 

 

 

 

дистилляционная

 

 

 

 

тор**

 

 

 

 

колонна

 

Стерилизация

 

 

 

 

 

(ректификация

 

 

 

 

 

в вакууме)

 

 

 

 

Возврат клеток

 

 

 

 

 

в производственный цикл

 

 

 

 

 

 

Пар

 

Отходы:

 

 

 

Вода

 

кормовые

 

 

Испаритель

Стриппинг-

 

добавки

 

 

 

 

 

 

 

 

колонна

* Только во время роста

 

 

Вода

Пар

 

 

 

** Экстрактор/установка для дистилляции/мембраны

 

 

Ферментация и дальнейшая переработка

Этанол

 

Питательные вещества

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

2

Сахарный тростник, меласса

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

из сахарной свеклы или осахаренный

 

 

 

 

 

 

 

 

 

кукурузный крахмал, соли

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Клеточный реактор

 

Биореактор

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Иммобилизованные

 

Объем до 500 м3,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

клетки, ферментация

 

ферментация в непрерыв-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

в непрерывном

 

 

ном или периодическом

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

режиме

 

 

режиме

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Происхождение атомов углерода в молекуле этанола

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Удаление этанола

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

при сбраживании глюкозы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Дистилляция или первапорация

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

Saccharomyces cerevisiae

 

 

 

 

 

Гликолиз

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Переработка отходов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

 

Zymomonas mobilis

 

путь Энтнера–Дудорова

 

 

 

 

 

 

 

 

Кормовые добавки для скота

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Организм

Система

Содержание

Скорость

Содержание Концентрация Максимальный

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

глюкозы,

истощения,

 

 

 

 

клеток,

этанола,

 

 

 

выход

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

г/л

 

 

ч–1

 

 

 

 

 

 

г/л

г/л

 

 

 

продукта, г/л

 

 

 

 

Saccharomyces Без возврата

100

0,17

 

12

41

 

7,0

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

cerevisiae

клеток в цикл

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

S. cerevisiae

С возвратом

100

0,08

 

50

43

 

29

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

клеток в цикл

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

S. cerevisiae

С возвратом

150

0,53

 

48

60,5

 

32

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

клеток в цикл

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

S. cerevisiae

С возвратом клеток

334

0,23

 

124

110–160

82

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

в цикл, вакуум (6,7 кПа)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Zymomonas

С возвратом

100

2,7

 

 

38

44,5

 

120

 

 

 

3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

mobilis

клеток в цикл

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

21

 

 

 

 

ATCC 4126;

 

NRLL Y-132;

 

ATCC 10988 – штаммы микроорганизмов

 

 

 

1

 

 

2

3

 

 

 

аминокислоты

1-Бутанол, ацетон

ВВЕДЕНИЕ. 1-Бутанол имеет очень важное значение

 

 

как растворитель лаков, используемых при покраске

 

автомобилей, а также как сырье в промышленном син-

 

тезе (в реакциях этерификации). Объем мирового

и

производства бутанола составляет 1,2 млн т в год. Ра-

ньше бутанол служил сырьем при получении синтети-

кислоты

ческого каучука из бутадиена. Ацетон также очень

 

 

важный растворитель. В мире за год производится

 

около 3 млн т ацетона. В современном производстве

Спирты,

основным источником сырья для синтеза этих соеди-

нений служат продукты нефтехимической промышлен-

ности. До 1950 г. ацетон и 1-бутанол получали в ос-

новном при сбраживании мелассы или крахмала с

помощью анаэробных бактерий рода Clostridium.

 

В связи с новыми возможностями, которые открыва-

 

ются в эпоху развития биотехнологии, ферментатив-

 

ных методов получения ацетона и 1-бутанола вновь

 

приобрели значение после их оптимизации и рассмат-

 

риваются в качестве «резервных» технологий.

 

МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Среди немного-

 

численных бактерий-продуцентов ацетона и 1-бута-

 

нола наиболее важное значение в производственных

 

технологиях имеют анаэробные бактерии рода Clo-

 

stridium. В ацетоно-бутиловом брожении можно вы-

 

делить две фазы: первая – бактерии активно размно-

 

жаются, и в среде накапливаются ацетат и бутират,

 

что приводит к понижению рН до 5,0. При таком низ-

 

ком рН размножение бактерий практически заканчи-

 

вается, и брожение переходит во вторую фазу – на-

 

копление 1-бутанола и ацетона, образующихся из

 

имеющихся в среде углеводов и накопленных в пер-

 

вой фазе кислот. Состав конечного продукта зависит

 

от используемого бактериального штамма. Наиболее

 

хорошо изучена физиология Clostridium acetobutyli-

 

сum, который обладает самой высокой продуктив-

 

ностью, а также достаточно устойчив к токсичному

 

действию 1-бутанола. При сбраживании 100 г глюко-

 

зы с помощью Clostridium acetobutyliсum образуется

 

38 г смеси бутанола и ацетона в соотношении 3:1.

 

Многие представители рода Clostridium содержат

 

амилазы, амилоглюкозидазы и другие внеклеточные

 

деполимеразы, поэтому для их культивирования

 

можно использовать такое дешевое питательное ве-

 

щество, как крахмал. Перспективным признано при-

 

менение лактозы (в виде молочной сыворотки). К на-

 

стоящему времени изучены механизмы действия и

 

регуляции практически всех ферментов, участвую-

 

щих в биосинтезе ацетона и 1-бутанола, гены боль-

 

шинства этих ферментов уже клонированы. При гли-

 

колизе из глюкозы образуется пируват, который под

 

действием фермента пируват:ферредоксин-оксидо-

 

редуктазы декарбоксилируется с образованием аце-

22

тил-КоА. Продуцируемые в процессе гликолиза вос-

становительные эквиваленты (прежде всего NADH)

обеспечивают дальнейшие превращения ацетил-КоА в С2-, С3- или С4-соединения. В реакции, катализируемой гидрогеназой, молекулярный водород служит донором электронов. Знание механизмов регуляции активности этого фермента может позволить осуществлять контроль за составом конечного продукта (metabolic engineering), поэтому в настоящее время ведутся активные исследования, посвященные изучению гидрогеназы. Геном C. acetobutyliсum полностью прочитан, и с этим микроорганизмом возможны генетические манипуляции. Так, разработаны челночные векторы для C. acetobutyliсum и Escherichia coli и Bacillus subtilis, а также системы с использованием транспозонов и специфических фагов. Методами генетической инженерии на основе диких и мутантных штаммов удалось значительно повысить выход ацетона и 1-бутанола.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ПРОЦЕСС И ПЕРВИЧНАЯ ОБРАБОТКА. В течение более 40 лет ферментативное получение ацетона и 1-бутанола с помощью C. acetobutyliсum в промышленных масштабах осуществляли в ферментерах с рабочим объемом более 100 м3. При этом около 60% производственных затрат приходилось на закупку сырья, а примерно 12% – на энергетические расходы при дистилляции. В современном производстве используются двустадийные технологии с возвратом клеток в производственный цикл, непрерывная ферментация, технологии с иммобилизацией клеток, а также усовершенствованные технологии выделения продуктов ферментации (первапорация, обратный осмос). Традиционные технологии, которые применялись в Северной Америке и ЮАР, с периодическим режимом культивирования клеток на кукурузном крахмале или мелассе в качестве сырья менее выгоден по сравнению с получением ацетона и 1-бутанола из продуктов нефтехимии. Экономическая целесообразность использования той или иной технологии определяется расходом сырья (кг продукта/кг сахара) и продуктивность (кг продукта/(час литр культуры)). Технология совершенствуется по двум направлениям. Во-первых, генно-инженерными методами удалось получить штаммы, устойчивые к токсичному действию ацетона и 1-бутанола, а изучение биохимических и физиологических особенностей жизнедеятельности микроорганизмов привело к созданию новых штаммов-суперпродуцентов. Во-вторых, можно повысить эффективность производства путем совершенствования самого технологического процесса, в том числе условий ферментации и выделения продуктов. На фоне постоянно растущих цен на нефть метод ферментативного получения ацетона и 1-бутанола, вероятно, вновь приобретет важное значение.

1-Бутанол

 

 

 

Ацетон

 

 

С4Н10О

Н3С—СН2—СН2—СН2—ОН

 

С3Н6О

 

Н3С—СО—СН3

MR

74,12

 

 

 

MR

58,08

 

d

0,81

 

 

 

d

0,7908

 

Ткип

117–118 °С

 

 

 

Ткип

56 °С

 

Код CAS

71-36-3

 

 

 

Код CAS

67-64-1

 

Химический синтез:

 

 

 

Каталитическое дегидрирование 2-пропанола

гидроформилирование пропилена

 

 

 

Прямое окисление пропилена

с последующим гидрированием

 

 

 

Расщепление кумолгидропероксида

Биосинтез

 

 

 

 

 

 

 

Глюкоза

 

Крахмал, сыворотка и т. д.

 

 

 

 

 

 

 

 

1

Пируват: ферредоксин-

 

 

 

 

 

 

 

оксидоредуктаза

2 лактат

2 пируват

 

 

 

 

2

Гидрогеназа

 

 

 

 

3

Тиолаза

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

КоА-трансфераза/

 

1

2 Н2 + 2 СО2

 

 

 

 

 

 

ацетацетат-декарбоксилаза

 

 

 

 

 

 

5

Альдегид/

2 ацетат

2-ацетил-КоА

 

2 этанол

 

 

 

алкогольдегидрогеназа

 

 

 

6

Две гидрогеназы,

 

 

 

 

 

 

 

3

СО2

 

 

 

7

кротоназа

 

 

 

 

 

Бутиральдегиддегидрогеназа

 

ацетоацетил-

 

 

 

 

 

и бутанолдегидрогеназа

 

 

ацетон

 

2-пропанол

 

 

КоА

4

5

 

 

 

 

 

Гены всех указанных

 

6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ферментов клонированы

 

 

 

 

 

 

 

бутират

бутирил-КоА

7

1-бутанол

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ферментация и первичная обработка

 

 

 

 

 

 

Споры

 

Сбраживание глюкозы под действием

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Clostridium acetobutylicum

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Суспензия в образце почвы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

%

 

 

Фаза

 

 

Фаза образования

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

образования

 

растворителей

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Жидкая культура

 

глюкозыКонцентрацияв среде,

100

 

кислот

 

 

 

 

рН

 

 

5,0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

рН

 

 

 

Анаэробные условия,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

24 ч при 37 °С

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Бутанол

 

 

 

культурыпродукта/млмг

 

 

 

 

 

80

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4,0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Биореактор

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

объемом 15 м3

 

 

60

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пропускание СО2,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

18 ч при 37 °С

 

 

40

 

 

 

 

 

 

 

 

Бутират

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ацетат

 

 

 

 

Биореактор

 

 

20

 

 

 

 

 

Ацетон

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

объемом 700 м3

 

 

 

 

 

 

 

 

Глюкоза

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6% меласса,

 

 

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

50–60 ч при 37 °С

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

8

16

24

32

40

48

Время, ч

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Непрерывная

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Микроорганизм

 

 

 

Выход продукта, %

 

 

 

 

дистилляция

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Затем фракционная

 

 

 

 

 

 

 

 

1-Бутанол

Ацетон

2-Пропанол

Этанол

 

 

 

перегонка

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Clostridium acetobutylicum

 

30,2

 

14,0

5,0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C. beijerinckii

 

 

 

67,9

 

6,0

 

 

 

Около 38 кг

 

C. puniceum

 

 

 

75,6

 

16,8

 

 

 

смеси 1-бутанол : ацетон

 

C. tetanomorphum

 

 

47,1

 

42,7

 

 

 

(3 : 1) из 100 кг глюкозы

 

 

 

 

 

 

 

 

C. butyricum

 

 

 

17,0

 

7,0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

23