Методы генетической инженерии

244

Методы генетической инженерии

246

Экспрессия генов

ВВЕДЕНИЕ. Основной целью большинства биотехнологических исследований является экспрессия генов или целых оперонов (нескольких генов, транскрибируемых с образованием одной молекулы мРНК). Для экспрессии в клетки вводят вектор. В зависимости от выбора клеток-хозяев вектор может реплицироваться вне хромосомы (например, у бактериальных клеток, в том числе E. coli) или встраиваться в хромосому хозяина (практически во всех эукариотических системах). Наличие индуцибельного промотора для клонированного гена позволяет «включать» и «выключать» экспрессию гена путем изменения условий. В случае высших организмов (растений и животных) к гену часто добавляют последовательности ДНК, кодирующие специфические сигнальные последовательности аминокислот. Такие последовательности обеспечивают транспорт генного продукта в определенные клеточные компартменты или направляют его по пути экзоцитоза.

ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ. Вектор, предназначенный для экспрессии в прокариотических клетках, например в E. coli, кроме клонированного структурного гена или оперона содержит сайт начала репликации и ген устойчивости к антибиотику. Экспрессия, т. е. образование, гена является результатом действия целого ряда регуляторных факторов и соответствующих белков – ферментов и факторов транскрипции и трансляции. В клетке E. coli фермент РНК-полимераза, осуществляющая транскрипцию, связывается с регуляторным участком–про- мотором, для которого характерно наличие определенных консервативных последовательностей в области –35 и –10 нуклеотидов до сайта инициации транскрипции, и начинает транскрипцию гена. Транскрипция заканчивается, когда РНК-полимераза достигает участка ДНК, где расположен терминатор транскрипции, обеспечивающий во многих случаях образование шпильки в синтезируемой мРНК. Для эффективной экспрессии обычно выбирают индуцибельные промоторы. Так, промотор лактозного оперона E. coli активируется (индуцируется) при добавлении в среду индуктора – изопропилтио-β-D-галактозида (IPTG). Индуктор взаимодействует с белком – репрессором лактозного оперона – и предотвращает его связывание с ДНК, при этом освобождается место для РНК-полимеразы, и транскрипция возобновляется. В настоящее время разработано много векторов для экспрессии. Все они содержат так называемые полилинкерные участки, в которых находятся уникальные сайты рестрикции, удобные для встраивания генов.

ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ имеют такую же структуру, как и векторы для экспрессии в прокариотах, и содержат следующие функциональные элементы: генетический маркер,

обеспечивающий селекцию трансформированных клеток, индуцируемый эукариотический промотор с консенсусными последовательностями (TATA-, CCAAT- и GC-боксами), сайт инициации транскрипции (стартовый кодон ATG), сайт терминации транскрипции, сигнал полиаденилирования мРНК и полилинкер для встраивания генов. Полученные генные продукты могут направляться в различные клеточные компартменты благодаря наличию специфических сигнальных последовательностей. Векторы для экспрессии в эукариотических клетках редко реплицируются автономно: как правило, они встраиваются в хромосому хозяина в результате рекомбинации. Чтобы осуществлять отбор трансформированных клеток млекопитающих, в вектор встраивают селективные маркерные гены, например ген дигидрофолатредуктазы или неомицинфосфотрансферазы. В среду роста клеток после трансфекции добавляют токсичные соединения метотрексат или неомицин. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии этих соединений, а клетки, несущие вектор, и, следовательно, способные инактивировать токсины, выживают. Для отбора клеток с бо’ льшим числом копий вектора увеличивают концентрацию токсинов в среде.

ПРОМОТОРЫ. В зависимости от уровня экспрессии гена (т. е. количества образующегося белкового продукта) различают сильные и слабые промоторы. Для многих естественных промоторов описано явление «подтекания» – наличие невысокого уровня экспрессии даже в присутствии репрессора. В генно-инже- нерных экспериментах обычно выбирают «неподтекающий» индуцибельный промотор необходимой силы, что позволяет, изменяя условия роста клеток, полностью подавлять или включать экспрессию гена. Типичными для экспрессии в клетках E. coli являются lac-, trp- и tac-промоторы, которые можно индуцировать добавлением специфических реагентов в среду роста бактерии. Экспрессия генов, встроенных под промотор λPL, индуцируется при повышении температуры от 30 до 42 °С. Для клонирования и экспрессии генов в грибах используют галактозный промотор GAL10 (Saccharomyces cerevisiae), промотор алкогольоксидазы AOX (Pichia pastoris) или промотор глюкоамилазы (Aspergillus). Промотор металлотионеина часто выбирают для экспрессии генов в животных клетках. При работе с трансгенными растениями и животными удобно использовать промотор, который регулируется процессами, протекающими в орга- низме-хозяине. Например, в экспериментах с трансгенными животными исследуемый ген часто встраивают под сильный промотор, специфический для молочных желез. Индукция экспрессии гена происходит при лактации, и таким образом удается получать достаточно большие количества рекомбинантного белка непосредственно из молока.