Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы

ВВЕДЕНИЕ. Хроматографические методы занимают важное место среди методов очистки биотехнологических продуктов. Для расчета оптимальных условий хроматографического процесса в колонке пользуются уравнением Ван-Деемтера. В зависимости от принципа разделения выделяют 1) гель-хроматогра- фию (по молекулярной массе), 2) адсорбционную хроматографию (гидрофильные/гидрофобные взаимодействия), 3) ионообменную хроматографию (по заряду), 4) изоэлектрофокусирование (по изоэлектрическим точкам) и 5) аффинную хроматографию (основана на специфическом взаимодействии с лигандами). Для выделения рекомбинантных белков чаще всего используют метод аффинной хроматографии, для которой разработано большое количество

разнообразных приборов, носителей и реагентов. На-

..

пример, система Аkta-System™ позволяет в течение нескольких часов подобрать оптимальные условия очистки белкового продукта. В лабораторных условиях хроматографическое разделение белков часто проводят, подавая элюент под высоким давлением (например, высокоэффективная жидкостная хроматография белков, или англ. fast protein liquid chromatography, FPLC). Для разделения белков в больших объемах также используют методы хроматографии, однако разделение под высоким давлением в промышленности осуществляется очень редко.

ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ. В качестве носителя наиболее часто используют декстрановые или агарозные гели. Изменяя состав геля (т. е. содержание в нем декстрана или агарозы), можно регулировать размер пор. После частичного алкилирования гидроксильных групп на таком носителе можно работать с органическими растворителями.

АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. Гидроксиапатит – самый широко используемый гидрофильный носитель для адсорбционной хроматографии. В качестве гидрофобных носителей применяют бутилили фенилсефарозные гели. Разделение основано на гидрофобных или гидрофильных взаимодействиях между компонентами смеси и материалом носителя.

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. Ионообменную хроматографию обычно применяют для разделения смеси белков. Метод часто используется для очистки продуктов биотехнологической промышленности. Смесь пропускают через колонку с неподвижным слоем ионообменной смолы. Смолы представляют собой производные полисахаридов с сульфонильными (катионит) или аминогруппами (анионит). Разделение происходит в зависимости от заряда белка при определенных значениях рН.

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. Этот элегантный метод основан на взаимодействии белков со специфическими лигандами, иммобилизованными на носителе. Например, для выделения дегидрогеназ используют производное декстрана с необычной структурой. Определенные группы такого носителя взаимодействуют с дегидрогеназой непосредственно в ее участке связывания с NADH. Для элюирования связавшегося белка используют низкомолекулярные соединения, конкурирующие с носителем за участки связывания с белком. В промышленности очистку препаратов для фармацевтического применения проводят методом иммунной хроматографии. На носителе иммобилизуют моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с белком. Элюирование связавшегося продукта происходит при повышении ионной силы раствора или закислении среды. В лабораторных условиях процедура очистки рекомбинантного белка часто облегчается путем его специфической модификации. Например, рекомбинантный белок часто экспрессируют слитым с другим белком, для которого процедура очистки хорошо разработана. Таким «партнером» для облегчения выделения может служить стрептавидин. Для выделения слитых со стрептавидином белков используют колонки, на которых иммобилизован биотин. Другой распространенный метод модификации белка с целью облегчения его очистки заключается в генетически запрограмированном надстраивании С- или N-конца последовательностью из нескольких (4–6) остатков гистидина (таг) с использованием методов генетической инженерии. Белок, содержащий такую последовательность, с высокой эффективностью связывается с носителем – никельсодержащим производным полисахарида. Часто при оптимизации выделения белка прибегают к таким модификациям, чтобы обработка выделенного продукта специфическими протеиназами вновь приводила к образованию исходного белка.

ВВЕДЕНИЕ. При разработке и оптимизации биотехнологических процессов важную роль играют экономические факторы. Экономика диктует следующие важные цели: 1) разработать простые и технически надежные процессы; 2) минимизировать капитальные затраты, а также по возможности сократить персонал; 3) повысить эффективность производства: использовать дешевые энергоносители и сырье, повысить выход продукта, сократить время проведения технологического процесса; 4) разработать недорогие методы переработки отходов и очистки стоков.

УПРОЩЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ. В биотехнологической промышленности, где производство практически всегда состоит из множества отдельных стадий, и возможность объединить хотя бы две стадии получения или обработки продукта имеет важное экономическое значение. Так, в произодстве антибиотиков широкое распространение получил декантатор фирмы Westphalia, позволивший одновременно осуществлять стадии отделения клеток и экстракции растворителем. Обеспечение личной безопасности персонала во время технологического процесса является важнейшим критерием. В биотехнологической промышленности кроме обычных правил техники безопасности, связанных с инженерным обслуживанием системы, особое значение имеют меры по предотвращению заражения персонала инфекционными заболеваниями при работе с патогенными штаммами. Полная стерильность процесса также имеет очень важное экономическое значение: попадание нежелательных микроорганизмов в ферментер в результате неудовлетворительной стерилизации может привести к потере большого объема продукта и к значительным финансовым потерям.

УМЕНЬШЕНИЕ КАПИТАЛЬНЫХ ЗАТРАТ И СОКРАЩЕНИЕ ПЕРСОНАЛА. От 10 до 40% стоимости биотехнологического продукта составляют затраты на оплату труда персонала. Обычный процесс ферментации и очистки продукта занимает около недели: как правило, процесс постоянно контролируется персоналом, работающим посменно. Объем капитальных затрат на биотехнологическое производство составляет 107–108 евро. Амортизационные отчисления и страховые расходы составляют около 10% капитальных затрат.

СЫРЬЕ И ЭНЕРГОНОСИТЕЛИ. Основные энергетические затраты связаны с работой систем стерилизации, охлаждения ферментера и перемешивания культуральных жидкостей. Крупные промышленные ферментеры стерилизуют в непрерывном режиме (140 °С, 4 мин). В процессе роста клеток около половины полученной при переработке питательных веществ энергии высвобождается в виде тепла, при перемешивании также выделяется тепло. Для отвода тепла крупных ферментеров используются охлажда-

ющие рубашки или змеевики. В современных производствах система теплообменников позволяет рационально использовать до 90% выделившейся при культивировании микроорганизмов энергии. При проведении ферментации по традиционной технологии 30–60% затрат приходится на закупку сырья, прежде всего источников углерода. В последнее время все большее распространение получают сложные среды, например на основе мелассы или соевого молока. Применение таких сред экономически выгодно, однако их недостатком является непостоянство состава. Мерам стандартизации и контроля качества сырья в промышленности уделяется большое внимание.

БИОМАССА И ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД. В процессе ферментации образуется биомасса и сточные воды с высоким показателем БПК5. Например, при производстве лимонной кислоты в реакторе объемом 300 м3 образуется около 15 тонн (сырой вес) клеточной массы Aspergillus niger. По экологическим соображениям биомассу, образовавшуюся при ферментации, сжигают. Это достаточно дорогая операция, если учесть высокое содержание воды в клетках. Как правило, продукт ферментации оказывается сильно разбавленным: обычно это раствор, в котором концентрация продукта не превышает 10%. В результате концентрирования и очистки продукта образуется большое количество стоков, загрязненных питательными веществами, сульфатом кальция, растворителями и т. д. Очистка сточных вод вносит значительный вклад в производственные затраты.

АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОЦЕССА. Любой технологический процесс можно разделить на стадии и составить экономическую характеристику каждой стадии. Таким образом, можно установить, какая из стадий требует наибольших затрат, и попытаться ее оптимизировать. Разработаны специальные компьютерные программы, с помощью которых можно учесть практически все сложные экономические взаимосвязи в биотехнологическом производстве.