- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Основы биотехнологических методов
208
Технология ферментации
ВВЕДЕНИЕ. Правильный расчет конструкции биореактора так же важен для осуществления экономически выгодного процесса ферментации, как и сведения о биологических характеристиках используемых микроорганизмов, полученные при биологических и биохимических исследованиях. Основные цели усовершенствования биореакторов заключаются в повышении безопасности проведения ферментации и минимизации промышленных затрат. При оптимизации конструкции биореактора рассматриваются следующие наиболее важные аспекты: 1) перемешивание среды роста микроорганизмов; 2) соблюдение температурного режима и 3) снабжение клеток кислородом в случае аэробной ферментации.
ПЕРЕМЕШИВАНИЕ в биореакторе осуществляется с помощью механического устройства или путем пропускания воздуха или другого газа. При перемешивании возникают турбулентные потоки, которые можно математически описать, используя число Рейнольдса (Re). Значение числа Рейнольдса обратно пропорционально вязкости среды – параметра, который в случае образующих мицелий организмов зависит от стадии роста микроорганизма и от концентрации продукта в среде. Наиболее наглядна зависимость скорости турбулентных потоков от количества продукта в среде в случае получения ксантановой смолы. Биореактор идеального перемешивания – это математическая модель, которую используют для изучения закономерностей роста микроорганизмов в биореакторе. В этом идеализированном случае считается, что концентрация любого компонента среды одинакова во всем объеме реактора, т. е. среда абсолютно гомогенна. На практике такая ситуация недостижима, так как любой биологический материал не идеальная жидкость: так, клетки мицелия весьма чувствительны к механическому воздействию, поэтому необходимо подбирать условия, обеспечивающие наиболее эффективное перемешивание и в то же время сохраняющие жизнеспособность биологического материала. На эффективность перемешивания влияет множество факторов: форма реактора, конструкция мешалок, их число и скорость вращения для реакторов с механическим перемешиванием или способ подачи газа (барботажная колонна или инжекторная подача) и конструкция насосов для аэроперемешивания. Число Ne – коэффициент мощности – отражает потребление энергии в процессе перемешивания содержимого реактора. В случае, когда через среду не пропускают газ, значение Ne связано с числом Рейнольдса. Для перемешивания в промышленных биореакторах разработано несколько конструкций, позволяющих эффективно проводить аэрацию и перемешивание. К таким устройствам относятся, например, крыльчатые диски и турбинные мешалки.
Эффективность перемешивания описывается объемным коэффициентом массопередачи kLa.
ПОДДЕРЖАНИЕ ПОСТОЯННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ – необходимое условие для оптимального течения процесса ферментации. При росте микроорганизмов высвобождается большое количество энергии в виде тепла, перемешивающие устройства также выделяют тепло. Кроме того, определенный вклад вносят процессы общей теплопередачи и теплообмена на границах фаз. Обычно системы охлаждения с помощью змеевиков или охлаждающих рубашек достаточно для поддержания температуры ферментации на определенном уровне. Однако в некоторых случаях, например при использовании в качестве источников углерода алканов или метанола, требуются дополнительные устройства для охлаждения реактора.
АЭРАЦИЯ. Рост аэробных организмов замедляется, если концентрация кислорода в среде ниже некоторого критического значения. При подборе оптимальных условий аэрации учитывают биологические и технические особенности ферментации. Во-первых, оптимальная скорость переноса кислорода в реакторе зависит от максимальной скорости потребления кислорода микроорганизмами. Во-вторых, не следует забывать о том, что кислород в условиях ферментера находится в трехфазной системе (газ–питатель- ная среда–клетка), и транспорт в такой сложной системе также должен быть оптимизирован. Общее сопротивление обмену кислорода складывается из отдельных сопротивлений в последовательных процессах переноса кислорода от газового пузырька до клетки: 1) диффузия газа к границе раздела фаз газ–жидкость; 2) перенос через границу раздела фаз газ–жидкость; 3) транспорт через жидкость к микроорганизму; 4) транспорт внутри клетки. В случае одноклеточных микроорганизмов на скорость переноса кислорода значительно влияет скорость диффузии кислорода к скоплениям клеток или мицелию. На процесс транспорта кислорода в жидкости влияет множество факторов: 1) технологические (размер реактора, заполненность реактора, эффективность перемешивания, интенсивность аэрации); 2) физикохимические (плотность и вязкость среды, температура, поверхностные свойства (необходимо добавление пеногасителей!)); 3) биологические характеристики микроорганизма (форма клеток). Важный показатель массообмена кислорода kLa можно измерить экспериментально.
Перемешивание в реакторе |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Мешалка типа MIG |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Мешалка типа |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Inter-MIG |
|
Крыльчатые диски |
|
|
Турбинные мешалки |
|||||
|
|
|
Характеристики турбулентных потоков |
||||||
|
Число Рейнольдса (Re) |
|
|
|
|
||||
|
Re = |
Сила инерции |
= |
d |
2nρ |
(безразмерная величина) |
|||
|
|
Вязкость |
|
R |
|||||
|
|
|
|
|
η |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Потребление энергии |
||||
|
Показатель мощности (Ne) |
|
|
|
|||||
|
Ne = |
|
Сила тяги |
= |
|
Po |
(безразмерная величина) |
||
|
Сила инерции |
dR5n3ρ |
|||||||
|
dR |
= |
Диаметр мешалки, м |
η |
= |
Динамическая вязкость |
|||
|
n |
= |
Скорость вращения |
|
|
раствора, Па с |
|||
Подача воздуха |
Подача воздуха |
|
мешалки, с–1 |
|
|
Po |
= |
Мощность мешалки, Вт |
|
|
|
|
|
|
ρ |
= |
Плотность, кг/м3 |
Системы аэрации реакторов
Перфорированное |
Перфорированная |
Инжектор |
Мешалка с устройством |
кольцо |
пластина |
|
для аэрации |
|
|
|
Газ |
Жид- |
|
|
Жид- |
кость |
|
|
кость |
|
|
Газ |
|
Газ |
Газ |
|
Жидкость |
|
|
|
|
|
|
|
|
Потребность в кислороде |
|
|
|
Скорость поглощения кислорода |
|
||||||
QO |
|
= XqO |
|
= kLa (CO* – CO ), моль/(л ч) |
qO2 |
= qO2max |
CO |
2 |
, моль/(л ч) |
|
|
|||||
|
|
2 |
|
2 |
2 |
2 |
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
KO2 |
+ CO2 |
|
|
|||||||||
q |
|
max = Максимальная скорость поглощения |
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
O2 |
кислорода, моль/г ч |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
CO2 |
= Концентрация растворенного кислорода, моль/л |
||||||||||||
qO2 |
= Скорость поглощения кислорода, моль/г ч |
C |
* = Насыщающая концентрация кислорода, моль/л |
|||||||||||||
|
|
|
= Объемный коэффициент массопередачи (kLa), ч–1 |
|
O2 |
|
|
|
|
|
|
|
||||
kLa |
K |
O2 |
= Константа Михаэлиса для О |
, моль/л |
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
X= Концентрация биомассы, г/л
|
Кислородный обмен: |
|
|
|
|
Объемная скорость подачи воздуха |
|
|
||||
|
коэффициент массопередачи kLa |
|
|
|
|
Объем воздуха |
||||||
|
|
P α |
B = |
|
, мин–1 |
|||||||
|
|
Емкость реактора мин |
||||||||||
|
kLa = |
|
(uG0)β, ч–1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
VR |
Показатель аэрации (NВ) |
|||||||||
|
k, α, β = Константы (безразмерная величина) |
NB = |
|
VG |
(безразмерная величина) |
|||||||
|
ndR3 |
|||||||||||
|
P |
= Мощность мешалки, Вт |
|
|
|
|
|
|
||||
|
VG |
= Скорость потока газа, м3/с |
||||||||||
|
VR |
= Объем реактора, м3 |
n |
= Скорость вращения мешалки, с–1 |
||||||||
|
uG0 |
= Скорость подачи газа, м/с |
dR |
= |
Диаметр мешалки, м |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
209 |
методов |
Промышленные процессы ферментации |
|||||
ВВЕДЕНИЕ. Переход от процесса, разработанного |
300 л, а в промышленности применяются реакторы с |
|||||
биотехнологических |
в лаборатории, к промышленному производству не |
рабочим объемом до 500 м3. При ферментации в |
||||
сводится к простому увеличению масштаба. В зави- |
больших объемах значительными оказываются энер- |
|||||
|
||||||
|
симости от технологического процесса используются |
гетические затраты на обеспечение быстрого пере- |
||||
|
различные конструкции биореакторов, среди которых |
мешивания среды и отвода тепла для сохранения по- |
||||
|
наибольшее |
распространение получили |
реакторы |
стоянной температуры. В масштабных производствах |
||
|
с перемешиванием. Обычно процесс перехода к |
(например, производстве глутаминовой кислоты, |
||||
|
большим объемам производства осуществляется по- |
белков одноклеточных организмов или при очистке |
||||
|
этапно (30 л → 300 л → 3000 л → промышленные |
стоков) используют эрлифтные реакторы объемом до |
||||
|
масштабы). |
|
|
|
1500 м3, в которых аэрация осуществляется за счет |
|
|
МАСШТАБИРОВАНИЕ. Уже на уровне эксперимен- |
внутренней или внешней рециркуляции газа. |
||||
Основы |
тальных цехов биореакторы снабжены мешалками, |
КОНТРОЛЬНО-ИЗМЕРИТЕЛЬНАЯ АППАРАТУРА. Конт- |
||||
турбинами, насосами и специальными устройствами |
роль условий культивирования необходим и в экспе- |
|||||
|
||||||
|
для аэрации. Все эти инженерные приспособления |
риментальных установках для подбора оптимальных |
||||
|
необходимы для создания оптимальных условий |
параметров, и в ходе производственного процесса. |
||||
|
культивирования клеток. При переходе к промышлен- |
Обычно измеряют следующие характеристики: вес |
||||
|
ным масштабам производства необходимо учиты- |
клеточной массы, температуру культуральной жидко- |
||||
|
вать, что в больших реакторах время перемешивания |
сти, скорость вращения и потребляемую мощность |
||||
|
должно быть значительно увеличено. Для того чтобы |
перемешивающих устройств, содержание кислорода и |
||||
|
в реакторе объемом более 150 м3 достичь обычной |
рН среды. Часто в отработанных газах анализируют |
||||
|
для небольших объемов скорости вращения мешал- |
содержание СО2 (методом ИК-спектроскопии) и О2 |
||||
|
ки, потребуются огромные энергозатраты. Из этих же |
(методом парамагнитного резонанса). По результа- |
||||
|
соображений крайне редко в промышленности ис- |
там всех анализов получают полную картину техноло- |
||||
|
пользуют рекомбинантные организмы, содержащие |
гического процесса. Состав продукта и расход суб- |
||||
|
плазмиды с промотором фага λ: при повышении |
страта определяют путем периодического отбора проб |
||||
|
температуры, что необходимо для индукции генов |
без нарушения стерильности системы. Из-за больших |
||||
|
под λ-промотором, может нарушить стабильное те- |
затрат на проведение ферментации и высоких цен на |
||||
|
чение процесса в большом реакторе. При расчете па- |
сырье, ведется постоянный поиск возможностей для |
||||
|
раметров аэрации учитывают повышенную чувстви- |
снижения затрат (технологический процесс получения |
||||
|
тельность клеток стрептомицетов, Aspergillus и |
продукта с рыночной ценой около 10 евро/кг в фер- |
||||
|
Penicillum к механическому воздействию. Аналогич- |
ментере объемом 100 м3 с выходом продукта 100 г/л |
||||
|
ные аспекты принимают во внимание, когда рассмат- |
обходится в 100 000 евро). |
||||
|
ривают прохождение газа через среду, а также отве- |
ПРОБЛЕМА ПЕНООБРАЗОВАНИЯ В ФЕРМЕНТЕРАХ. |
||||
|
дение образовавшегося |
тепла с |
помощью |
Интенсивная аэрация жидких сред, содержащих бел- |
||
|
теплообменников. |
|
|
ки, часто сопровождается нежелательным пенообра- |
||
|
ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ. Первыми в промышленности |
зованием. Для предотвращения этого обычно ис- |
||||
|
были применены поверхностные реакторы (для про- |
пользуют механические сбиватели пены, а при |
||||
|
изводства лимонной кислоты) и пленочные биореак- |
образовании слишком большого количества пены в |
||||
|
торы (биофильтры для аэробной очистки сточных |
среду добавляют химические пеногасители (напри- |
||||
|
вод). Такие конструкции относительно просты в экс- |
мер, эруковую кислоту или силиконы). Однако следу- |
||||
|
плуатации, однако удельный выход продукта невелик. |
ет помнить, что присутствие химических реагентов |
||||
|
В современной промышленности наибольшее рас- |
может значительно усложнять процедуру очистки |
||||
|
пространение получили реакторы с перемешивани- |
продукта, поэтому стараются использовать мини- |
||||
|
ем, снабженные системой контроля температуры и |
мальные количества пеногасителей. |
||||
|
интенсивности аэрации, вентилями для отбора проб и |
|
||||
|
стерильными |
элементами |
конструкции (трубы |
|
||
|
и т. д.). В процессах с многоступенчатой фермента- |
|
||||
|
цией используются реакторы с лопастными мешалка- |
|
||||
|
ми, а в случае одноклеточных организмов эрлифт- |
|
||||
|
ные реакторы или барботажные колонны. При |
|
||||
|
производстве уксусной кислоты и аэробной очистке |
|
||||
|
сточных вод применяют мешалки, засасывающие |
|
||||
210 |
воздух при вращении. Реакторы для исследователь- |
|
||||
ских целей, как правило, имеют объем не более |
|
Типы биореакторов |
|
|
|
|
Поверхностный биореактор |
Реакторы с механическим перемешиванием |
|||
Подача |
|
Турбинная |
С внутренними |
Мешалка, засасывающая |
влажного |
Выход |
мешалка |
трубками |
воздух при вращении |
воздуха |
воздуха |
Газ |
|
Газ |
|
|
Газ |
Газ |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Пере- |
|
|
|
|
город- |
|
|
|
|
ка |
Пластины |
|
|
|
|
с питательной средой |
|
|
Мотор |
|
|
|
|
Газ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Обычно такие реакторы имеют объем до 150 м3 |
|
Барботажные колонны, эрлифтные реакторы и реакторы с внутренним контуром |
||||
Барботажная |
Эрлифтный |
Реактор с внутренним |
Реактор с внешней |
|
колонна |
реактор |
контуром |
|
рециркуляцией |
Газ |
Газ |
Газ |
|
Газ |
|
Пере- |
|
|
Пере- |
|
город- |
|
|
город- |
|
ка |
|
|
ка |
|
|
|
|
L |
Газ |
Газ |
|
Газ |
Газ |
|
|
|||
Такие реакторы обычно имеют объем >150 м3 |
|
|
|
|
Скорость перемешивания в реакторах разного объема |
|
Объем биореактора, л |
3 |
9 |
100 |
300 |
1 000 |
3 000 |
24 000 |
Скорость вращения мешалки, об/мин |
750 |
2 000 |
230 |
350 |
200 |
180 |
30 |
Время перемешивания, с |
5 |
3 |
6,6 |
5 |
25 |
20 |
66 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Параметры процесса ферментации |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Физические параметры |
|
Химические параметры |
|
Биологические параметры |
|
|
|
|
Температура |
Величина рН |
Активность ферментов |
|
||||
|
Давление |
Растворенный кислород |
Содержание АТФ |
|
||||
|
Потребляемая мощность |
Содержание О2 и СО2 |
Содержание НАДФ |
|
||||
|
Вязкость |
в отработанных газах |
Содержание белков |
|
||||
|
Скорость прохожения газа |
Редокс-потенциал |
|
|
|
|||
|
Поступление среды |
Концентрация субстрата |
|
|
|
|||
|
Оптическая плотность среды |
Концентрация продукта |
|
|
|
|||
|
Вес ферментера |
Концентрация ионов |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Красным обозначены параметры, значение которых можно регулировать |
|
|
211 |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|