Методы генетической инженерии

ВВЕДЕНИЕ. В процессе размножения происходит пе-

ditis elegans) – 6, а человек – 23 хромосомы. Сово-

редача потомству генетической информации от одной

купность ДНК (хромосом) организма называется ге-

(в случае прокариот – при делении клетки) или двух

номом. Хромосомы находятся в клеточном ядре и

(у эукариот) родительских клеток. Генетическая ин-

формируют структуру, называемую хроматином. Хро-

формация представлена молекулами ДНК (дезокси-

матин представляет собой комплекс ДНК и основных

рибонуклеиновой кислоты) – биополимер с молеку-

белков (гистонов) в соотношении 1:1. Длину ДНК

лярной массой до 109, имеющий структуру двойной

обычно измеряют числом пар комплементарных

спирали. Этот принцип строения ДНК отличается для

нуклеотидов (п.н.). Например, 3-я хромосома чело-

различных организмов, что делает возможным обмен

века представляет собой молекулу ДНК размером

генетическим материалом между неродственными

160 млн п.н.. Выделенная линеаризованная ДНК

видами. Примером может служить вирусная инфек-

размером 3 106 п.н. имеет длину примерно 1 мм,

ция. В последние десятилетия бурно развиваются ме-

следовательно, линеаризованная молекула 3-й хро-

тоды такого гетерологического обмена в лаборатор-

мосомы человека была бы 5 мм в длину, а ДНК всех

ных условиях (методы генетической инженерии).

23 хромосом (~3 109 п.н., MR = 1,8 1012) гапло-

Технология рекомбинантных ДНК открывает новые

идной клетки – яйцеклетки или сперматозоида – в

возможности как в фундаментальных исследованиях,

линеаризованном виде составляла бы 1 м. За исклю-

так и в производственных технологиях.

чением половых клеток, все клетки организма чело-

СТРУКТУРА ДНК. ДНК – это линейный биополимер.

века (их около 1013) содержат двойной набор хромо-

Его мономерными единицами являются нуклеотиды,

сом. При клеточном делении все 46 молекул ДНК

состоящие из дезоксирибозо-5'-фосфата и одного из

реплицируются и снова организуются в 46 хромосом.

четырех азотистых оснований (аденина (А), гуанина

ДНК прокариот устроена более просто: их клетки не

(G), цитозина (C) или тимина (T)). Нуклеотиды в ДНК

имеют ядра, поэтому ДНК находится непосредствен-

соединены фосфодиэфирными связями таким обра-

но в цитоплазме в форме нуклеоида. Даже такой не-

зом, что фосфатная группа 5'-углеродного атома од-

большой геном, как кольцевая ДНК кишечной палоч-

ного нуклеотида связана с 3'-ОН-группой дезоксири-

ки Escherichia coli (M = 2,4 109), имеющая размер

бозы другого нуклеотида. Таким образом,

R

4,6 млн п.н., в развернутом виде составлял бы 1,5 мм.

биополимер ДНК представлен сахарофосфодиэфир-

Репликация этой молекулы в оптимальных условиях

ным остовом с двумя эфирными связями. Две цепи в

занимает около 20 минут (время удвоения E. coli).

этом полимере образуют двойную спираль, в которой

пуриновые (A и G) и пиримидиновые (C и T) основа-

ния обращены внутрь молекулы и специфически

связаны между собой водородными связями («гибри-

дизация»). Эти водородные мостики могут образовы-

вать между собой только аденин и тимин (две водо-

родные связи) и гуанин и цитозин (три водородные

связи), т. е. комплементарными основаниями. Высо-

комолекулярное соединение ДНК (двойная спираль)

обладает рядом характерных свойств. 1) Молекуляр-

ная масса ДНК достигает очень больших значений.

2) Расположенные вдоль цепей основания – это но-

сители генетической информации. 3) Цепи ДНК

имеют разное направление, так что 5'-конец одной

цепи соответствует 3'-концу другой цепи. 4) Каждая

цепь молекулы ДНК может служить матрицей для

образования новой комплементарной цепи в процес-

се репликации.

ВВЕДЕНИЕ. В ДНК содержится информация, опреде-

6 кодонов: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA и CUG. У раз-

ляющая синтез белков и их внутриклеточную локали-

личных организмов частота использования тех или

зацию. В прокариотических клетках процесс «перево-

иных кодонов неодинаковая, и это часто является

да» материала ДНК в белок осуществляется в два

причиной неудач при экспрессии клонированных

этапа: сначала происходит транскрипция, т. е. пере-

ДНК. В настоящее время установлены структуры

писывание кодирующего участка ДНК в информаци-

геномов многих организмов, использующихся в гене-

онную или матричную РНК (мРНК), а затем трансля-

тической инженерии, и полученная информация поз-

ция, при которой информация, записанная в мРНК,

воляет осуществить гетерологичную экспрессию в

используется для синтеза белка на рибосоме.

соответствии с частотой встречаемости кодонов.

У эукариот происходит более сложный процесс. Во-

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ. Синтетиче-

первых, только часть их молекулы ДНК является ма-

ские олигонуклеотиды широко используются в моле-

трицей для синтеза белков (такие участки называют-

кулярно-биологических экспериментах, например,

ся экзонами). До 90% ДНК не кодирует белков

в качестве праймеров (затравки для ДНК-полимера-

(например, интроны), и функция этих участков неиз-

зы) и зондов для гибридизации и сайт-направленного

вестна. После завершения транскрипции ДНК в РНК

мутагенеза. Правильно подобранный праймер специ-

происходит сплайсинг, т. е. вырезание интронов из

фически гибридизуется с денатурированой ДНК и

первичного транскрипта и «сшивание» экзонов.

может служить затравкой для синтеза определенного

Транскрипция и сплайсинг происходят в ядре, после

участка ДНК. Поскольку генетический код вырожден,

чего зрелые мРНК поступают в цитоплазму. Трансля-

т. е. каждой аминокислоте соответствуют несколько

ция осуществляется на рибосомах, расположенных в

кодонов, возможно использование нескольких вари-

цитоплазме или на поверхности эндоплазматическо-

антов праймеров для клонирования одного гена. Та-

го ретикулума. Отсюда синтезированные белки напра-

ким образом, исходя из аминокислотной последова-

вляются в различные внутриклеточные компартменты

тельности белка химическим способом синтезируют

в соответствии со специфическими сигнальными пос-

все возможные варианты праймеров и проводят гиб-

ледовательностями, содержащимися в их структуре.

ридизацию исследуемой ДНК со смесью полученных

Для функционирования многих белков необходимо,

праймеров. Если получен сигнал (методом Саузерна

чтобы белок претерпел особые химические модифика-

или ПЦР), свидетельствующий о том, что исследуе-

ции (посттрансляционные модификации), например

мая ДНК гибридизуется с одним из использованных

гликозилирование или фосфорилирование. По при-

праймеров, комплекс ДНК–праймер выделяют и оп-

близительным оценкам 30 000–40 000 генов челове-

ределяют структуру ДНК одним из методов секвени-

ка кодируют около двух миллионов различных белков.

рования.

Белковый состав клеток различного типа и возраста

сильно различается.