Эритропоэтин и другие факторы роста

ВВЕДЕНИЕ. Развитие техники работы с культурами клеток привело к обнаружению большого числа факторов роста (colony stimulating factors, CSF, колониестимулирующие факторы), которые стимулировали рост клеток в результате взаимодействия с рецепторами на клеточной поверхности. Эти факторы представляют собой цитокины – вещества, которые синтезируются клетками в очень малых количествах. Методами генетической инженерии можно получать их в необходимых количествах с целью изучения свойств, природы и механизма взаимодействия, а также возможностей терапевтического применения: особый интерес представляет направленное влияние на рост определенных типов клеток (клеток кожи, нервных клеток, эритроцитов, клеток костей и т.д.). Так, эритропоэтин, фактор роста гранулоцитов (G-CSF) и фактор роста гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) уже успешно применяются в медицине. Эритропоэтин стимулирует образование эритроцитов, G-CSF – нейтрофильных гранулоцитов, а GM-CSF – эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и макрофагов. Эти факторы назначают пациентам с анемией, которая часто возникает при проведении диализа. В Германии около 40 000 пациентов принимают эритропоэтин и около 100 000 – GM-CSF. Мировой объем рынка эритропоэтина составляет около 10 млрд долл. США, G-CSF и GM-CSF – около 3 млрд долл. США (2004 г.). ЭРИТРОПОЭТИН (ЕРО) – фактор роста эритроцитов. Интенсивность биосинтеза эритропоэтина в клетках эндотелия почек и клетках Купфера в печени зависит от парциального давления кислорода в крови. Под действием ЕРО гематопоэтические стволовые клетки костного мозга теряют ядра, и в них начинается синтез гемоглобина: так происходит созревание эритроцитов. Таким образом, ЕРО стимулирует обновление клеток крови, и поэтому он используется при лечении малокровия, развивающегося у пациентов, которым проводят диализ крови (искусственная почка). В последнее время наряду с эритропоэтином при лечении таких пациентов успешно используется комбинированный препарат: факторы роста GM-CSF или G-CSF, факторы роста гранулоцитов, макрофагов и моноцитов. Ген эритропоэтина из клеток костного мозга человека клонирован в 1984 г. Гликопротеин с молекулярной массой 34 кДа представляет собой полипептид из 165 аминокислотных остатков, который гликозилирован по трем атомам азота и одному атому кислорода. На углеводные цепи приходится около 40% молекулярной массы этого гликопротеина и они, по-видимому, имеют важное функциональное значение. По этой причине поиск клеток-хозяев для экспрессии биологически активного эритропоэтина оказался чрезвычайно сложной задачей. Высокий выход функционального гликопротеина был получен в клет-

ках СНО. Кристаллическая структура эритропоэтина, связанного с внеклеточными доменами его рецепторов, представлена в таблице.

ФАКТОРЫ РОСТА. Гликопротеины, входящие в состав большой группы факторов роста, специфически стимулируют размножение и созревание клеток соединительной ткани, а также нервных, костных и других клеток. К настоящему времени гены многих факторов роста клонированы, и некоторые рекомбинантные белки уже применяются в медицине или находятся на стадии клинических испытаний. Препараты, полученные на основе этих белков, используют для лечения невропатий, остеопороза и язвенной болезни. Исследуется возможность применения фактора роста эпителия для заживления ран, в том числе после удаления катаракты. Были получены трансгенные овцы, в которых активность фактора роста эпителия увеличена по сравнению с нормой, в результате рост шерсти у таких овец значительно усилился.

ПОЛУЧЕНИЕ. Эритропоэтин получают в биореакторах объемом до 1000 л с использованием культуры животных клеток, прежде всего – рекомбинантных СНО-клеток (клетки яичника китайского хомяка). Необходимость использования животных клеток для получения эритропоэтина связана с тем, что биологически активный белок должен быть гликозилирован. Процесс ферментации продолжается 30 сут, после чего рекомбинантный белок подвергают четырехстадийной хроматографической очистке. Физиологическое действие других факторов роста не зависит от того, гликозилированы они или нет, поэтому в качестве клеток-хозяев для получения таких рекомбинантных белков используют микроорганизмы. Так, GM-CSF и G-CSF получают в клетках рекомбинантных штаммов E. coli.

ВВЕДЕНИЕ. В настоящее время ведутся исследования возможностей медицинского использования более чем 300 рекомбинантных белков. Здесь будут рассмотрены цитокин (фактор некроза опухолей (TNF)), ДНКаза I и глюкоцереброзидаза.

ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ (TNF). Фактор некроза опухолей был обнаружен в результате наблюдения, что при бактериальной инфекции происходит замедление развития некоторых опухолей. Под действием бактериального эндотоксина, имеющего структуру липополисахарида, в активированных макрофагах, моноцитах, клетках-киллерах (NK-клетках), а также в клетках мозга и печени образуется фактор некроза опухолей. Существует два варианта TNF; их аминокислотные последовательности гомологичны лишь на 30%, однако эти гликопротеины проявляют сходные биологические свойства. TNFα (МR 17,3, 157 аминокислотных остатков) вырабатывается макрофагами. Рентгеноструктурный анализ молекулы TNFα выявил необычно высокое содержание β-складчатых слоев. Для TNFα обнаружены рецепторы двух типов. TNFβ (171 аминокислотный остаток) синтезируется в лимфоцитах (поэтому его иногда называют лимфотоксином) и связывается с теми же рецепторами, что и TNFα. Структура TNFβ мало изучена, поскольку большинство исследований были сосредоточены на TNFα. Было показано, что в системе in vitro TNFα обладает цитотоксическим действием по отношению к трансформированным клеткам, и это действие может быть усилено добавлением интерферона. Клинические испытания в системе in vivo не подтвердили эти наблюдения, и, кроме того, выявили опасные побочные эффекты (воспалительные реакции, артрит, повышенное артериальное давление и др.). TNFα играет важную роль во многих «положительных» и «отрицательных» реакциях, происходящих в организме: он определяет состояние септического шока и кахексию (истощение) в результате хронических инфекций или развития опухоли. TNFα также вовлечен в регуляцию образования других цитокинов и, вероятно, участвует в развитии аутоиммунных заболеваний (в частности, ревматоидного артрита) и отторжении трансплантата. Такое интересное «неоднозначное» действие TNF, а также возможность его получения в качестве рекомбинантного продукта (например, в клетках E. coli) послужили причиной активного изучения этого фактора.

ДНКАЗА I (Pulmozyme®). Муковисцидоз – наследственное заболевание, в большинстве случаев с летальным исходом, связанное с накоплением в легких слизи, затрудняющей дыхание. Повышенная вязкость слизи обусловлена присутствием внеклеточной ДНК из распадающихся лейкоцитов. Для лечения (ингаляции) используется рекомбинантная

ДНКаза I человека (260 аминокислотных остатков), синтезируемая в клетках СНО. Мировой объем рынка составляет около 300 млн долл. США (2004 г.). Выход рекомбинантного продукта в этих клетках удалось повысить благодаря экспрессии дигидрофолатредуктазы и присутствию в среде роста метотрексата. Активность природного фермента ингибируется G-актином, поэтому методами белковой инженерии был получен мутантный белок, устойчивый к действию актина, что повысило активность ДНКазы I в 10–50 раз. Применение ДНКазы I не излечивает пациентов, однако немного облегчает их состояние. Муковисцидоз – моногенное заболевание, и в последнее время ведется активное изучение возможностей генной терапии.

ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗА. Болезнь Гоше – наследственное заболевание, причиной которого является накопление глюкоцереброзидов в некоторых клетках в результате пониженного содержания глюкоцереброзидазы (CerezymeTM). В зависимости от клинических симптомов различают три варианта протекания болезни. Наиболее тяжелая форма I характеризуется болями в костях и отделах пищеварительного тракта. Эти симптомы могут быть сглажены при регулярном внутривенном введении глюкоцереброзидазы. Глюкоцереброзидазу человека получают из плаценты или в виде рекомбинантного продукта, образующегося в клетках СНО. Мировой объем рынка составляет около 850 млн долл. США (2004 г.).