Антибиотики

Антибиотики

Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам

СКРИНИНГ. Скрининг бактериальных штаммов с це-

ков – продуктов вторичного обмена веществ – начи-

лью выявления антимикробной активности осуществ-

нается после того, как клетки достигли стационарной

ляют по их влиянию на поведение контрольного

фазы роста. Как правило, антибиотики являются вне-

штамма. После того как на штамме выявлена анти-

клеточными продуктами аэробного обмена веществ и

микробная активность, антибиотик выделяют, очища-

плохо растворяются в воде. По окончании цикла фер-

ют и анализируют его структуру. Как правило, у ново-

ментации клетки удаляют центрифугированием, из

го антибиотика строение молекулы похоже на

среды экстрагируют растворенные в ней питательные

строение уже изученных веществ. Чтобы увеличить

вещества (эти два этапа выделения продукта можно

эффективность поиска штаммов-продуцентов анти-

объединять), а затем продукт очищают перекристал-

биотиков, разрабатывают новые методы скрининга,

лизацией или хроматографически. Промышленные

например с использованием биохимических или био-

процессы получения, очистки и подготовки антибио-

логических чипов, применяют новые химико-анали-

тиков, которые используются в медицинских целях,

тические методы, а также ищут возможные мишени

ведутся под строгим контролем в полном соответст-

для действия антибиотика (в библиотеках синтезиро-

вии с сертифицированными правилами организации

ванных соединений ищут вещества, действующие на

производства и контроля качества лекарственных

определенную функцию микроорганизма).

средств (Good Manufacturing Practice, ISO 9000).

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ

ШТАММОВ. Антибиотики

УСТОЙЧИВОСТЬ (РЕЗИСТЕНТНОСТЬ) К АНТИБИОТИ-

являются продуктами вторичного обмена веществ

КАМ. Микроорганизмы, обладающие устойчивостью

у микроорганизмов и выделяются в среду роста

к антибиотикам, весьма распространены, и это стало

в очень небольших количествах (несколько милли-

главной медицинской проблемой. Неуклонно растет

граммов на литр культуральной жидкости). Поэтому,

число штаммов Salmonella, Escherichia coli, стафило-

если обнаруженный антибиотик представляет инте-

кокков, стрептококков, а в последнее время и Myco-

рес, то перед исследователем встает задача повы-

bacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза),

сить уровень его синтеза. Усовершенствование

устойчивых к целому ряду антибиотиков. Самые важ-

штамма заключается в многократном повторении ак-

ные механизмы, обеспечивающие устойчивость мик-

тов мутагенеза с последующей селекцией и обрат-

роорганизма к действию антибиотиков, следующие:

ным «скрещиванием». Таким образом удается повы-

а) нарушение процесса поступления антибиотика в

сить выход антибиотика в 103–106 раз по сравнению

клетку или ускоренное выведение его из клетки (на-

с диким штаммом. Методы генетической инженерии,

пример, в результате изменения проницаемости

например, введение дополнительных копий генов

мембраны); б) специфические изменения структур,

ферментов, играющих ключевую роль в синтезе

являющихся мишенью действия антибиотика (изме-

антибиотиков, также позволяют получать новые

нения сайта связывания в рибосоме или молекуле

штаммы-суперпродуценты.

ДНК); в) генетически запрограммированные фер-

ФЕРМЕНТАЦИЯ И ПЕРЕРАБОТКА. У большинства анти-

ментативные реакции, обеспечивающие устойчи-

биотиков весьма сложная структурная формула, ча-

вость к антибиотику. Некоторые генетические дефек-

сто с несколькими стереоцентрами, поэтому химиче-

ты могут распространяться среди различных видов

ский синтез редко используется для их производства.

микроорганизмов с помощью плазмид, фагов или

Промышленное получение антибиотиков осуществля-

транспозонов. Таким образом, после обнаружения

ется ферментацией в биореакторах. Питательная сре-

нового антибиотика надо продолжить исследования,

да содержит такие недорогие источники углерода и

чтобы найти его аналоги на основе существующих ан-

азота, как меласса, лактоза и соевая мука. По мере

тибиотиков, применяемых, например, в сельском хо-

замедления роста из-за исчерпания питательных ве-

зяйстве для улучшения роста и профилактики забо-

ществ клеточная культура переходит в идиофазу:

леваний скота. Такие аналоги понадобятся для

именно тогда синтезируются антибиотики. Большин-

борьбы с патогенами, устойчивыми к действию суще-

ство штаммов-продуцентов антибиотиков устойчивы к

ствующих антибиотиков.

своим катаболитам только в этом состоянии, поэтому

для предотвращения

самоуничтожения система

должна быстро достичь идиофазы, а затем культиви-

ровать микроорганизмы в этой фазе. Если в качестве

продуцента антибиотиков используют грибы, или ак-

тиномицеты, наряду с оптимизацией состава пита-

тельной среды особое внимание уделяют концентра-

42

ции кислорода, так как клетки мицелия весьма

чувствительны к аэрации. Образование антибиоти-

Скрининг и отбор

Плесневые грибы,

1

1

Пробы микроорганизмов (мазки):

6

2

1

синтезирующие

6

2

Staphylococcus aureus

антибиотик

(грамположительная

Питательная

бактерия)

5

3среда на агаре5

3

2

Streptococcus sp.

4

(грамположительная

1

4

бактерия)

Пенициллин G

Гризеофульвин

3 Escherichia coli

6

2

(грамотрицательная

бактерия)

Агар, на котором

4

Pseudomonas aeruginosa

(грамотрицательная

растет контрольный

5

3

Замедленный

бактерия)

микроорганизм

рост

4

5

Candida albicans (дрожжи)

контрольного

Тетрациклин

6

Trichophyton rubrum (грибы)

микроорганизма

Усовершенствование штаммов

Гибрид

Обратное скрещивание

F7

50 000

Пенициллин

F6

продукта (ед./мл)

40 000

F5

и селекция

30 000

F4

20 000

Мутагенез

Выход

F3

Выход продукта

F2

10 000

в мутанте

Мутант, выбранный для

следующего раунда

F1

скрещивания

0

F1–F7 – дочерние поколения

Дикий штамм

1940

50

60

70

80

Устойчивость к антибиотику

а Изменение мишени действия антибиотика

б Ферментативные модификации

Белок, связывающийся с антибиотиком

или выведение антибиотика из клетки

Ингиби-

рование

Клеточная

АТРаза, осу-

стенка

ществляющая

Ингибирование

выведение

отсутствует

Ингиби-

Ингиби-

Плазмида

рование

рование

Модифицирующие

отсут-

РНК-поли-

ферменты

ствует

Ингиби-

мераза

рование

ДНК-топо-

Ферменты,

изомераза

ДНК

разрушающие

антибиотик

Ингибирование

отсутствует

Активная

Формы

Разные антибиотики

Неактивная

антибиотиков

43

Пенициллин

R

Название

Свойства

Изопенициллин N

Пенициллин G Неустойчив в кислой среде,

чувствителен к β-лактамазе

Ампициллин

Устойчив в кислой среде,

Ациль- β-Лактам-

Тиазолиди-

чувствителен к β-лактамазе,

ная

ное кольцо

новое кольцо

действует также на грам-

группа

отрицательные бактерии

Амоксициллин

Устойчив в кислой среде,

6β-Аминопеницилла-

чувствителен к β-лактамазе,

широкий спектр действия,

новая кислота (6-АРА)

высокая степень резорбции

Цефалоспорины

R1/R2

Название

Свойства

Цефалоспорин С Неустойчив в кислой

среде, чувствителен

к β-лактамазе

Ациль- β-Лактам-

Дигидротиази-

Цефаклор

Устойчив в кислой

ная

ное кольцо

новое кольцо

среде, не чувствите-

группа

лен к β-лактамазе,

7β-Аминоцефалоспорановая

широкий спектр

действия

кислота (7-АСА,

R2 = CH

–O–CO–CH

)

Цефотаксим

Устойчив в кислой

2

3

среде, не чувствите-

7β-Аминодезацетоксицефало-

лен к β-лактамазе,

очень широкий

спорановая кислота (7-АDСА,

спектр действия

R2 = CH3)

Биoсинтез и структура генных кластеров

L-α-Аминоадипиновая кислота + L-Цистеин + L-Валин

Фермент/ген

1 ACVS

pcbAB δ-L-α-Аминоадипил-L-цис-

1

2 IPNA

pcbC

теинил-D-валин-синтетаза

Изопенициллин-

3 AT

penDE

N-синтетаза

Ацил-КоА: изопенициллин-

4 IPNE

cefD

N-ацилтрансфераза

Изопенициллин-

N-эпимераза

δ-L-α-Аминоадипил-L-цистеинил-D-валин

5

REX/H cefEF

Экспандаза/гидроксилаза

6

AT

cefG

Ацил-КоА: цефалоспоран-

2

ацилтрансфераза

Изопенициллин N

Дезацетоксицефалоспорин C

4, 5

3

6

Пенициллин G

Цефалоспорин C

Структура генных кластеров

P. chrysogenum

A. chrysogenum

pcbAB

pcbC penDE

pcbAB

pcbC

cefEF cefG

45