Биоматериалы

ными белками, гены которых удалось клонировать и модифицировать для экспрессии в клетках E. coli и Pichia pastoris. Выход рекомбинантных белков фиброина и спидроина составляет около 1 г/л.

БЕЛКИ С АДГЕЗИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ. Мидии Mytilus edulis обладают способностью прикрепляться к раковинам ракообразных или поверхности обшивки кораблей

итаким образом перемещаться на большие расстояния. Эти моллюски синтезируют специфический белок, проявляющий адгезионные свойства. Белок-предшествен- ник имеет молекулярную массу 130 кДа и состоит преимущественно из полярных аминокислот – тирозина, серина, треонина, лизина и пролина. В ходе посттрансляционных модификаций остатки тирозина и пролина преобразуются в о-гидрокситирозин или 3- или 4-гидро- кси-L-пролин соответственно. На воздухе полипептиптидные цепи полимеризуются, и образуются дихиноны. Методами генетической инженерии удалось осуществить гетерологичную экспрессию фрагмента белка адгезии размером 25 кДа в клетках E. coli с достаточно высоким выходом. Однако в этих клетках-хозяевах не происходит посттрансляционных модификаций белков, поэтому выделенный рекомбинантный продукт обрабатывают ферментом тирозиназой, который гидролизует остатки тирозина до о-гидрокситирозина, что обеспечивает образование поперечных сшивок между полипептидными цепями. Полученный белок используют в медицинских целях, в том числе в стоматологии для заполнения полостей в зубе.

БАКТЕРИОРОДОПСИН. Галобактерия Halobacterium salinarum обитает в средах с повышенным содержанием поваренной соли: концентрация NaCl 3–5 М является нормальной для ее роста. При фототрофном росте бактериородопсин служит в качестве протонного насоса

итаким образом снабжает клетку энергией. Молекулы бактериородопсина формируют в клеточной мембране агрегаты (бляшки), которые легко выделяются в составе так называемой «пурпурной мембраны», на 75% по массе состоящей из белков и на 25% из липидов. Препараты «пурпурных мембран» очень стабильны. Кофактор бактериородопсина ретиналь и процесс его цис-транс- изомеризации связан с необычной функцией: бактериородопсин действует как светозависимый протонный насос, число оборотов которого может достигать 100 в секунду. В восстановленной форме бактериоро-

допсин имеет пурпурный цвет (λmax = 570 нм), а при протонировании ретиналя и остатка лизина в положе-

нии 216 становится желтым (λmax = 410нм). Замена определенных аминокислотных остатков путем направленного мутагенеза дает возможность регулировать скорость циклического светозависимого изменения цвета бактериородопсина. Чрезвычайно перспективным представляется использование бактериородопсина и его производных в качестве оптического носителя информации (фотоэлемента).

Специальные продукты

70

Биотрансформация

ВВЕДЕНИЕ. Биотрансформация – основная функция организма, необходимая для осуществления нормального обмена веществ и обезвреживания токсичных веществ, в том числе ксенобиотиков. В биотехнологии под термином биотрансформация принято понимать биокатализ, то есть процесс ферментативного превращения природного или синтетического вещества-предшественника в продукт с необходимыми свойствами. Этот процесс может осуществляться в биореакторах микроорганизмами, целыми клетками животных или растений, их отдельными органеллами, а также иммобилизованными на носителях ферментами или клетками. В последние годы сильно выросла роль генетической инженерии для усовершенствования ферментов и получения рекомбинантных организмов. Термины «биокатализ», «ферментация» и «биотрансформация» в определенном смысле можно считать синонимами. Процесс биотрансформации включает одну или несколько стадий – каждую стадию катализирует отдельный фермент. Применение выделенных ферментов имеет ряд преимуществ: можно оптимизировать температурный режим проведения реакции, так как белок менее чувствителен к условиям среды, чем более сложные биологические системы (органеллы или клетки); отсутствует необходимость поддерживать стерильные условия реакции; фермент взаимодействует с субстратом более эффективно. Использование органелл или целых клеток более целесообразно в тех случаях, когда выделение фермента является сложной процедурой, если очищенный фермент нестабилен или процесс трансформации включает несколько стадий и все необходимые ферменты находятся в клетке.

МИКРООРГАНИЗМЫ используются как для получения природных метаболитов (например, глу-тами- новой кислоты), так и для превращения веществ, которые не являются их природными субстратами (к примеру, гидроксилирование стероидов по 11β-по- ложению). Как правило, ферменты катализируют реакции нормального метаболизма с высокой субстратной специфичностью. Экспрессия генов или целых генных кластеров, клонированных из другого организма, позволяет расширить круг веществ, подвергающихся биотрансформации, как, к примеру, в случае получения индиго. Метаболическая инженерия и белковый дизайн позволяют находить новые метаболические пути на основе анализа генома и играют важную роль при разработке методов промышленной биотрансформации.

ЖИВОТНЫЕ КЛЕТКИ широко используются для синтеза фармацевтических препаратов и антител в биореакторах. В настоящее время проводятся работы по созданию искусственной печени для очищения крови от некоторых токсических веществ. Токсины, выделен-

ные из крови при диализе, в результате биотрансформации осаждаются на молекулах альбумина.

РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ. Наиболее известный пример использования растительных клеток для биотрансформации – реакции специфического гидроксилирования. Так, в культуре Digitalis lanata в результате гидроксилирования дигитоксина по положению 12 образуется дигоксин. Биореакторы для культивирования растительных клеток по техническим причинам пригодны лишь для ограниченного числа процессов, например для синтеза таксола (PaclitaxelTM) Taxus brevifolia.

ОТДЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ целесообразно применять, если реакция биотрансформации проходит всего в одну стадию и может протекать в системе in vitro. В большинстве случаев в промышленности используются не требующие кофакторов ферменты, например, для реакций субстрат-специфичного гидролиза или этерификации. В последнее время изолированные ферменты также стали применяться для осуществления реакций присоединения по двойной связи, например в карбонильных группах.

«РЕКОМБИНАНТНЫЕ» ПУТИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ. Наиболее яркими примерами использования этого подхода в промышленности является производство аскорбиновой кислоты в Erwinia herbicola (см. ранее)

иполучение индиго в рекомбинантных клетках Escherichia coli. Методами генетической инженерии в клетках E. coli была дополнительно усилена активность триптофаназы, катализирующей реакцию превращения триптофана в индол, а затем с помощью TOL-плазмиды в клетки был введен ген нафталиндиоксигеназы из Pseudomonas sp. Полученный рекомбинантный штамм обладает способностью синтезировать индиго – один из самых распространенных красителей для тканей. Для получения L- или D-аминокислоты из синтетических гидантоинов используют хозяйские клетки E. coli с векторными кассетами, содержащими рекомбинантные гидантоиназы

икарбамилазы («синтетическая биология»).