- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Биотехнология в медицине
132
Ингибиторы ферментов
ВВЕДЕНИЕ. В современной медицине широко используются ингибиторы ферментов. Например, ингибитор протеаз апротинин, получаемый из отходов при переработке мяса, применяют для терапии шоковых состояний, а рекомбинантный α1-антитрипсин в будущем, возможно, найдет применение для лечения эмфиземы легких. Множество микробных ингибиторов протеаз (лейпептины, пепстатин, антипаин, химостатин, эластиналь) пока не нашли применения
вмедицине, однако активно используются в фундаментальных исследованиях. Ингибитор α-гликозидазы акарбозу успешно применяют при лечении диабета, а ингибитор панкреатической липазы тетрагидролипстатин – при лечении ожирения.
АПРОТИНИН – полипептид, состоящий из 58 амино-
кислот (МR 6511), ингибирует такие протеазы как трипсин, химотрипсин и плазмин. Другое название апротинина – панкреатический ингибитор трипсина. Константа ингибирования трипсина с помощью апротинина составляет 10–11 М. Лекарственные препараты, содержащие апротинин (Trasylol®), применяют для лечения панкреатитов, при трансплантации органов, а также при сильных кровотечениях и шоковых состояниях. Перспективным считается применение апротинина в работе с культурами животных клеток:
вэтом случае апротинин препятствует протеолитическому расщеплению рекомбинантных белков. Апротинин экстрагируют из поджелудочной железы или легких крупного рогатого скота, а затем очищают хроматографическими методами. Белок негликозилирован, следовательно, может быть получен как рекомбинантный продукт в бактериальных клетках, в том числе в Escherichia coli.
α1-АНТИТРИПСИН (α-АТ). Этот гликопротеин (МR 54 кДа), закодированный в 14-й хромосоме человека, образуется в печени и при концентрации ~2 г/л ингибирует более 90% всей ферментативной
активности, проявляющейся во фракции α1-глобули- нов сыворотки крови. Одним из субстратов α1-анти- трипсина является эластаза, образующаяся в нейтрофильных гранулоцитах и осуществляющая протеолитическое расщепление эластина – основного структурного компонента легочной ткани. Таким образом, α-АТ предотвращает разрушение ткани легких. В Северной Европе у населения нередко встречается генетический дефект α-АТ – замена Lys53 на Glu (такой α-АТ называется α-АТ Z-типа). В случае такой мутации значительно снижается уровень секреции α-АТ из клеток печени, и его содержание в крови составляет лишь 15% нормы. Наличие α-антитрипсина Z-типа особенно опасно для курящих, так как в табаке содержатся вещества, окисляющие Met358 α-АТ, который играет важную роль при ингибировании эластазы. Под действием эластазы в легочной ткани
развиваются эмфиземы, что в большинстве случаев вызывает удушье и смерть. Внутривенное введение ингибиторов эластазы (около 200 г в год) позволяет замедлить развитие болезни. Основным источником α-АТ является кровь доноров. Для получения рекомбинантного ингибитора предпочитают клетки Saccharomyces cerevisiae, так как биологически активный α-АТ должен быть гликозилирован, следовательно, продукт, образующийся в клетках E. coli, оказывается неактивным. Экономически выгодна экспрессия рекомбинантного α-АТ, слитого с β-лактальбумином, в молочных железах овцы.
АКАРБОЗА (Glucobay®) – это псевдотетрасахарид, получаемый из культур Actinoplanes utahensis. Акарбоза является конкурентным ингибитором α-глюко- зидаз. Под действием акарбозы в желудочно-кишеч- ном тракте снижается уровень глюкозы, поэтому ее применяют в качестве антидиабетического средства. Производство акарбозы основано на микробной ферментации. К настоящему времени клонированы некоторые гены, участвующие в биосинтезе акарбозы.
ЛИПСТАТИН (ЛИПОСТАТИН) – липофильный эфир, содержащий β-лактоновое кольцо и боковую цепь, несущую N-формил-L-лейцин. Это вещество получают из культуры Streptomyces toxytricinii. В результате каталитического гидрирования из липстатина образуется тетрагидролипстатин (Xenical®). Оба вещества (липстатин и тетрагидролипстатин) ковалентно связываются с остатком серина в активном центре липаз. При оральном применении этих веществ в желудочно-кишечном тракте происходит ингибирование панкреатической липазы, осуществляющей гидролиз триглицеридов, а переваривание свободных жирных кислот не нарушается. По этой причине при ожирении назначают прием тетрагидролипстатина. Липстатин и тетрагидролипстатин получают химическим синтезом или ферментацией в клетках Streptomyces toxytricinii с последующей экстракцией и хроматографической очисткой. Объем рынка в США составляет около 500 млн долл. (2004 г.).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
|
α1-Aнтитрипсин – ингибитор протеаз |
|
|
|
|
Зеленым показана |
|
Структура эластазы |
структура |
||
человека, установ- |
α1-антитрипсина |
||
ленная методом |
человека |
||
рентгено- |
(разрешение |
||
структурного |
0,16 нм) (1-ATS) |
||
анализа, |
|
||
с разрешением |
|
||
0,16 нм (1-EGS) |
|
||
|
|
|
MR = 54 кДа |
|
|
|
Код CAS = 9041-92-3 |
|
|
|
|
|
Акарбоза – ингибитор α-глюкозидазы |
|
|
|
MR = 645,61 |
||
|
|
|
|
|
|
|
Код CAS = 56180-94-0 |
Акарбоза |
Акарбоза взаимодействует с модельной мишенью |
(зеленый цвет) панкреатической амилазы свиньи (1PAA). |
По данным рентгено-структурного анализа с разрешением 0,23 нм |
Тетрагидроксилипстатин (Xenical®) – ингибитор липаз |
MR = 495,74 |
Код CAS = 96829-58-2 |
Структура комплекса тетрагидроксилипстатина |
(зеленый цвет) с панкреатической липазой |
человека (1 HUP). Разрешение 0,23 нм |
Получение ингибиторов |
|
|
|
α1-Антитрипсин |
Акарбоза |
Тетрагидроксилипстатин |
|
Трансгенные овцы |
Предферментация |
Предферментация |
|
Штамм–cуперпродуцент |
Штамм–cуперпродуцент |
||
«Tracy» |
|||
|
Actinoplanes utahensis |
Streptomyces toxytricinii |
|
|
Биореактор |
Биореактор |
|
Молоко |
Объем несколько кубометров; |
Объем несколько кубометров; среда, |
|
среда, содержащая крахмал; |
содержащая крахмал, или декстрин; |
||
|
|||
|
мальтоза, 5–6 сут при 28 °С |
соевая мука, 124 ч при 28 °С |
|
Выделение и очистка |
Выделение и очистка |
Выделение и очистка |
|
Осаждение казеина, |
Фильтрация, ионообменная |
Фильтрация, экстракция этилацетатом, |
|
хроматография |
хроматография |
обращенно-фазовая хроматография |
|
Выход продукта: 10 мг чистого |
Выход продукта: |
Выход продукта: |
|
α1-антитрипсина/л молока |
несколько г/л |
несколько г/л |
|
|
|
133 |
медицине |
Иммунная система |
|
организмы от инфекционных болезней и многих пато- |
||
|
ВВЕДЕНИЕ. Иммунная система защищает высшие |
|
в |
генов. Функционирование иммунной системы обеспе- |
|
Биотехнология |
||
чивают специализированные клетки, которые сообща- |
||
|
||
|
ются между собой и другими клетками организма с |
|
|
помощью особых сигнальных веществ-регуляторов. |
|
|
Цитотоксические Т-клетки иммунной системы способ- |
|
|
ны узнавать не только возбудителей болезни, но и |
|
|
собственные поврежденные клетки организма (апоп- |
|
|
тоз), в том числе раковые клетки. Т-клетки также при- |
|
|
нимают участие в отторжении чужеродной ткани при |
|
|
трансплантации. Генетически запрограммированное |
|
|
разнообразие и изменчивость иммунной системы |
|
|
позволяет ей приспосабливаться к изменяющимся |
|
|
условиям окружающей среды. Нарушения функцио- |
|
|
нирования иммунной системы приводят к различ- |
|
|
ным патологиям, среди которых иммунодефицит, |
|
|
аллергии, аутоиммунные болезни. В регуляции им- |
|
|
мунной системы принимают участие множество ве- |
|
|
ществ (цитокины, факторы роста и др.), некоторые |
|
|
уже доступны как рекомбинантные продукты. |
Внастоящее время изучаются возможности их терапевтического применения.
КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ. В костном мозге продуцируются гематопоэтические стволовые клетки, которые затем дифференцируются в миелоидные или лимфатические стволовые клетки. Миелоидные стволовые клетки дают начало тромбоцитам, гранулоцитам и макрофагам, а из лимфатических стволовых клеток образуются лимфоциты, поступающие в кровь
илимфатическую систему. В организме здорового взрослого человека присутствует около 1012 «наивных» лимфоцитов, которые еще не вступали в контакт с антигенами. При взаимодействии таких клеток с антигеном (или под действием сигнальных веществ) происходит активация лимфоцитов, и путем селективного клонирования образуется большое количество дочерних клеток, специфических к этому антигену. Лимфоциты продложают дифференцировку до В-кле- ток и Т-лимфоцитов. Созревшие в костном мозге В-клетки поступают в селезенку или лимфатические узлы и в ответ на действие антигена синтезируют антитела (гуморальный иммунный ответ). Клеточный иммунный ответ осуществляется Т-лимфоцитами. Т-лимфоциты созревают в тимусе. Там они взаимодействуют с молекулами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC), экспонированными на поверхности клеток.
Врезультате этого взаимодействия образуются специфические поверхностные структуры с различными функциями. В создании клеточного иммунного ответа важная роль принадлежит цитокинам – они секретируются Т-лимфоцитами. Например, клетки-помощни-
134 ки (Т-хелперы) выделяют интерлейкины, которые ак-
тивируют деление и созревание В-клеток. Т-хелперы несут на своей поверхности гликопротеин CD4. Цитотоксические Т-лимфоциты (клетки-киллеры) обладают способностью лизировать зараженные вирусом клетки и выделять цитокины: γ-интерферон и лимфотоксин α. На поверхности клеток-киллеров находится гликопротеин CD8.
ИММУННЫЙ ОТВЕТ И ЦИТОКИНЫ. В организме существуют различные специфическе механизмы иммунного ответа на инфекции, вызываемые вирусами, бактериями или паразитами. Антитела обладают способностью специфически связываться с внеклеточными патогенами или их токсинами, и такие комплексы служат сигналом для макрофагов, которые уничтожают патоген. Внутриклеточные патогены, например микобактерии или вирусы, а также трансформированные клетки, экспрессирующие гетерологичный белковый продукт, разрушаются по другому механизму: в результате встречи таких патогенов с макрофагом на его поверхности оказываются экспонированными фрагменты лизированных клеток. Это запускает целый каскад реакций, приводящих к разрушению инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. При диабете II типа (аутоиммунное заболевание) собственные белки β-клеток поджелудочной железы воспринимаются иммунной системой как чужие и разрушаются под действием клеток-кил- леров. Взаимодействие большого количества клеток, участвующих в формировании иммунного ответа, осуществяется посредством цитокинов. Клетки иммунной системы несут на своей поверхности рецепторы для цитокинов. Формирование иммунного ответа в организме регулируется по сложному механизму. Факторы роста, специфические для различных типов клеток, обеспечивают образование новых клеток иммунной системы. В настоящее время активно изучаются возможности использования рекомбинантных цитокинов и факторов роста в медицинских целях, и в некоторых случаях уже разработаны стратегии их терапевтического применения.
Процесс кроветворения и иммунный ответ: типы клеток
|
|
|
Плюрипотентная |
CD4+ T-клетки |
|
||
|
Тромбоциты |
|
стволовая клетка |
|
|||
|
|
|
|
|
(Т-хелперы, ТН1) |
|
|
Эозинофильные |
|
|
|
|
|
CD4+ T-клетки |
|
гранулоциты |
|
|
|
|
|
(Т-хелперы, ТН2) |
|
Нейтрофильные |
Миелоидная |
|
Лимфоидная |
|
|||
гранулоциты |
|
|
|||||
стволовая клетка |
стволовая клетка |
CD8+ T-клетки |
|||||
|
|||||||
Базофильные |
|
|
|
|
(цитотоксические |
||
|
|
|
|
|
Т-лимфоциты, |
||
гранулоциты |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
ЦТЛ) |
||
|
|
|
|
|
|
||
Тучные клетки |
|
Дендритные |
|
|
|
||
|
клетки |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
Натуральные |
В-клетки |
|
|
|
|
|
|
клетки-киллеры |
|
|
Макрофаги (в тканях организма) |
Моноциты (в крови) |
|
(НК-клетки) |
|
|||
Некоторые цитокины и факторы роста |
|
|
|
|
|||
|
Название |
|
Тип клетки, |
|
Функция |
|
|
|
|
|
где образуется |
|
|
||
|
|
|
цитокин |
|
|
|
|
Активация лимфоцитов Интерлейкин-2 |
|
ТН1, (ЦТЛ) |
|
Пролиферация Т-клеток |
|
||
|
γ-Интерферон |
|
ТН1, ЦТЛ |
|
Активация макрофагов |
|
|
|
Интерлейкин-4 |
|
ТН2 |
|
Фактор роста В-клеток |
|
|
|
Интерлейкин-3 |
|
ТН1, ТН2, (ЦТЛ) |
Пролиферация гематопоэтических клеток |
|||
Местное воспаление |
Интерлейкин-9 |
|
Т-клетки |
|
Активация тучных клеток |
|
|
|
α-Интерферон |
|
Лейкоциты, |
|
Индукция синтеза антигенов MHC класса I |
||
|
|
|
фибробласты |
|
|
|
|
|
ФНО-α |
|
Макрофаги, |
|
Развитие местного воспаления |
||
|
|
|
клетки-киллеры |
|
|
||
Системные эффекты |
Интерлейкины 1α, 1β |
Различные типы |
Повышение температуры, пролиферация |
||||
и специфические |
|
|
клеток |
|
гематопоэтических клеток |
|
|
воздействия |
|
|
|
|
|
|
|
на костный мозг |
|
|
|
|
|
|
|
|
Интерлейкин-6 |
|
ТН2, макрофаги |
Индукция синтеза белков острой фазы |
|||
|
Эритропоэтин |
|
Почки |
|
Активация роста эритробластов |
||
|
Колониестимулирующий ТН1, (ТН2), (ЦТЛ) |
Активация пролиферации |
|
||||
|
фактор гранулоцитов |
|
|
предшественников гранулоцитов, |
|||
|
и макрофагов |
|
|
|
макрофагов и дендритных клеток |
Терапевтическое применение цитокинов и факторов роста
Инфекции |
Злокачественные опухоли |
Шоковые состояния |
Аутоиммунные заболевания |
Заболевания иммунной системы |
Аллергические реакции |
Нарушения клеточного роста |
Отторжение трансплантата |
135