Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия..pdf
Скачиваний:
521
Добавлен:
30.05.2021
Размер:
9.07 Mб
Скачать

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотехнология в медицине

132

Ингибиторы ферментов

ВВЕДЕНИЕ. В современной медицине широко используются ингибиторы ферментов. Например, ингибитор протеаз апротинин, получаемый из отходов при переработке мяса, применяют для терапии шоковых состояний, а рекомбинантный α1-антитрипсин в будущем, возможно, найдет применение для лечения эмфиземы легких. Множество микробных ингибиторов протеаз (лейпептины, пепстатин, антипаин, химостатин, эластиналь) пока не нашли применения

вмедицине, однако активно используются в фундаментальных исследованиях. Ингибитор α-гликозидазы акарбозу успешно применяют при лечении диабета, а ингибитор панкреатической липазы тетрагидролипстатин – при лечении ожирения.

АПРОТИНИН – полипептид, состоящий из 58 амино-

кислот (МR 6511), ингибирует такие протеазы как трипсин, химотрипсин и плазмин. Другое название апротинина – панкреатический ингибитор трипсина. Константа ингибирования трипсина с помощью апротинина составляет 10–11 М. Лекарственные препараты, содержащие апротинин (Trasylol®), применяют для лечения панкреатитов, при трансплантации органов, а также при сильных кровотечениях и шоковых состояниях. Перспективным считается применение апротинина в работе с культурами животных клеток:

вэтом случае апротинин препятствует протеолитическому расщеплению рекомбинантных белков. Апротинин экстрагируют из поджелудочной железы или легких крупного рогатого скота, а затем очищают хроматографическими методами. Белок негликозилирован, следовательно, может быть получен как рекомбинантный продукт в бактериальных клетках, в том числе в Escherichia coli.

α1-АНТИТРИПСИН (α-АТ). Этот гликопротеин (МR 54 кДа), закодированный в 14-й хромосоме человека, образуется в печени и при концентрации ~2 г/л ингибирует более 90% всей ферментативной

активности, проявляющейся во фракции α1-глобули- нов сыворотки крови. Одним из субстратов α1-анти- трипсина является эластаза, образующаяся в нейтрофильных гранулоцитах и осуществляющая протеолитическое расщепление эластина – основного структурного компонента легочной ткани. Таким образом, α-АТ предотвращает разрушение ткани легких. В Северной Европе у населения нередко встречается генетический дефект α-АТ – замена Lys53 на Glu (такой α-АТ называется α-АТ Z-типа). В случае такой мутации значительно снижается уровень секреции α-АТ из клеток печени, и его содержание в крови составляет лишь 15% нормы. Наличие α-антитрипсина Z-типа особенно опасно для курящих, так как в табаке содержатся вещества, окисляющие Met358 α-АТ, который играет важную роль при ингибировании эластазы. Под действием эластазы в легочной ткани

развиваются эмфиземы, что в большинстве случаев вызывает удушье и смерть. Внутривенное введение ингибиторов эластазы (около 200 г в год) позволяет замедлить развитие болезни. Основным источником α-АТ является кровь доноров. Для получения рекомбинантного ингибитора предпочитают клетки Saccharomyces cerevisiae, так как биологически активный α-АТ должен быть гликозилирован, следовательно, продукт, образующийся в клетках E. coli, оказывается неактивным. Экономически выгодна экспрессия рекомбинантного α-АТ, слитого с β-лактальбумином, в молочных железах овцы.

АКАРБОЗА (Glucobay®) – это псевдотетрасахарид, получаемый из культур Actinoplanes utahensis. Акарбоза является конкурентным ингибитором α-глюко- зидаз. Под действием акарбозы в желудочно-кишеч- ном тракте снижается уровень глюкозы, поэтому ее применяют в качестве антидиабетического средства. Производство акарбозы основано на микробной ферментации. К настоящему времени клонированы некоторые гены, участвующие в биосинтезе акарбозы.

ЛИПСТАТИН (ЛИПОСТАТИН) – липофильный эфир, содержащий β-лактоновое кольцо и боковую цепь, несущую N-формил-L-лейцин. Это вещество получают из культуры Streptomyces toxytricinii. В результате каталитического гидрирования из липстатина образуется тетрагидролипстатин (Xenical®). Оба вещества (липстатин и тетрагидролипстатин) ковалентно связываются с остатком серина в активном центре липаз. При оральном применении этих веществ в желудочно-кишечном тракте происходит ингибирование панкреатической липазы, осуществляющей гидролиз триглицеридов, а переваривание свободных жирных кислот не нарушается. По этой причине при ожирении назначают прием тетрагидролипстатина. Липстатин и тетрагидролипстатин получают химическим синтезом или ферментацией в клетках Streptomyces toxytricinii с последующей экстракцией и хроматографической очисткой. Объем рынка в США составляет около 500 млн долл. (2004 г.).

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

 

α1-Aнтитрипсин – ингибитор протеаз

 

 

 

 

Зеленым показана

Структура эластазы

структура

человека, установ-

α1-антитрипсина

ленная методом

человека

рентгено-

(разрешение

структурного

0,16 нм) (1-ATS)

анализа,

 

с разрешением

 

0,16 нм (1-EGS)

 

 

 

 

MR = 54 кДа

 

 

 

Код CAS = 9041-92-3

 

 

 

 

Акарбоза – ингибитор α-глюкозидазы

 

 

MR = 645,61

 

 

 

 

 

 

Код CAS = 56180-94-0

Акарбоза

Акарбоза взаимодействует с модельной мишенью

(зеленый цвет) панкреатической амилазы свиньи (1PAA).

По данным рентгено-структурного анализа с разрешением 0,23 нм

Тетрагидроксилипстатин (Xenical®) – ингибитор липаз

MR = 495,74

Код CAS = 96829-58-2

Структура комплекса тетрагидроксилипстатина

(зеленый цвет) с панкреатической липазой

человека (1 HUP). Разрешение 0,23 нм

Получение ингибиторов

 

 

α1-Антитрипсин

Акарбоза

Тетрагидроксилипстатин

Трансгенные овцы

Предферментация

Предферментация

Штамм–cуперпродуцент

Штамм–cуперпродуцент

«Tracy»

 

Actinoplanes utahensis

Streptomyces toxytricinii

 

Биореактор

Биореактор

Молоко

Объем несколько кубометров;

Объем несколько кубометров; среда,

среда, содержащая крахмал;

содержащая крахмал, или декстрин;

 

 

мальтоза, 5–6 сут при 28 °С

соевая мука, 124 ч при 28 °С

Выделение и очистка

Выделение и очистка

Выделение и очистка

Осаждение казеина,

Фильтрация, ионообменная

Фильтрация, экстракция этилацетатом,

хроматография

хроматография

обращенно-фазовая хроматография

Выход продукта: 10 мг чистого

Выход продукта:

Выход продукта:

α1-антитрипсина/л молока

несколько г/л

несколько г/л

 

 

133

медицине

Иммунная система

организмы от инфекционных болезней и многих пато-

 

ВВЕДЕНИЕ. Иммунная система защищает высшие

в

генов. Функционирование иммунной системы обеспе-

Биотехнология

чивают специализированные клетки, которые сообща-

 

 

ются между собой и другими клетками организма с

 

помощью особых сигнальных веществ-регуляторов.

 

Цитотоксические Т-клетки иммунной системы способ-

 

ны узнавать не только возбудителей болезни, но и

 

собственные поврежденные клетки организма (апоп-

 

тоз), в том числе раковые клетки. Т-клетки также при-

 

нимают участие в отторжении чужеродной ткани при

 

трансплантации. Генетически запрограммированное

 

разнообразие и изменчивость иммунной системы

 

позволяет ей приспосабливаться к изменяющимся

 

условиям окружающей среды. Нарушения функцио-

 

нирования иммунной системы приводят к различ-

 

ным патологиям, среди которых иммунодефицит,

 

аллергии, аутоиммунные болезни. В регуляции им-

 

мунной системы принимают участие множество ве-

 

ществ (цитокины, факторы роста и др.), некоторые

 

уже доступны как рекомбинантные продукты.

Внастоящее время изучаются возможности их терапевтического применения.

КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ. В костном мозге продуцируются гематопоэтические стволовые клетки, которые затем дифференцируются в миелоидные или лимфатические стволовые клетки. Миелоидные стволовые клетки дают начало тромбоцитам, гранулоцитам и макрофагам, а из лимфатических стволовых клеток образуются лимфоциты, поступающие в кровь

илимфатическую систему. В организме здорового взрослого человека присутствует около 1012 «наивных» лимфоцитов, которые еще не вступали в контакт с антигенами. При взаимодействии таких клеток с антигеном (или под действием сигнальных веществ) происходит активация лимфоцитов, и путем селективного клонирования образуется большое количество дочерних клеток, специфических к этому антигену. Лимфоциты продложают дифференцировку до В-кле- ток и Т-лимфоцитов. Созревшие в костном мозге В-клетки поступают в селезенку или лимфатические узлы и в ответ на действие антигена синтезируют антитела (гуморальный иммунный ответ). Клеточный иммунный ответ осуществляется Т-лимфоцитами. Т-лимфоциты созревают в тимусе. Там они взаимодействуют с молекулами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC), экспонированными на поверхности клеток.

Врезультате этого взаимодействия образуются специфические поверхностные структуры с различными функциями. В создании клеточного иммунного ответа важная роль принадлежит цитокинам – они секретируются Т-лимфоцитами. Например, клетки-помощни-

134 ки (Т-хелперы) выделяют интерлейкины, которые ак-

тивируют деление и созревание В-клеток. Т-хелперы несут на своей поверхности гликопротеин CD4. Цитотоксические Т-лимфоциты (клетки-киллеры) обладают способностью лизировать зараженные вирусом клетки и выделять цитокины: γ-интерферон и лимфотоксин α. На поверхности клеток-киллеров находится гликопротеин CD8.

ИММУННЫЙ ОТВЕТ И ЦИТОКИНЫ. В организме существуют различные специфическе механизмы иммунного ответа на инфекции, вызываемые вирусами, бактериями или паразитами. Антитела обладают способностью специфически связываться с внеклеточными патогенами или их токсинами, и такие комплексы служат сигналом для макрофагов, которые уничтожают патоген. Внутриклеточные патогены, например микобактерии или вирусы, а также трансформированные клетки, экспрессирующие гетерологичный белковый продукт, разрушаются по другому механизму: в результате встречи таких патогенов с макрофагом на его поверхности оказываются экспонированными фрагменты лизированных клеток. Это запускает целый каскад реакций, приводящих к разрушению инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. При диабете II типа (аутоиммунное заболевание) собственные белки β-клеток поджелудочной железы воспринимаются иммунной системой как чужие и разрушаются под действием клеток-кил- леров. Взаимодействие большого количества клеток, участвующих в формировании иммунного ответа, осуществяется посредством цитокинов. Клетки иммунной системы несут на своей поверхности рецепторы для цитокинов. Формирование иммунного ответа в организме регулируется по сложному механизму. Факторы роста, специфические для различных типов клеток, обеспечивают образование новых клеток иммунной системы. В настоящее время активно изучаются возможности использования рекомбинантных цитокинов и факторов роста в медицинских целях, и в некоторых случаях уже разработаны стратегии их терапевтического применения.

Процесс кроветворения и иммунный ответ: типы клеток

 

 

 

Плюрипотентная

CD4+ T-клетки

 

 

Тромбоциты

 

стволовая клетка

 

 

 

 

 

 

(Т-хелперы, ТН1)

 

Эозинофильные

 

 

 

 

 

CD4+ T-клетки

гранулоциты

 

 

 

 

 

(Т-хелперы, ТН2)

Нейтрофильные

Миелоидная

 

Лимфоидная

 

гранулоциты

 

 

стволовая клетка

стволовая клетка

CD8+ T-клетки

 

Базофильные

 

 

 

 

(цитотоксические

 

 

 

 

 

Т-лимфоциты,

гранулоциты

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЦТЛ)

 

 

 

 

 

 

Тучные клетки

 

Дендритные

 

 

 

 

клетки

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Натуральные

В-клетки

 

 

 

 

 

клетки-киллеры

 

Макрофаги (в тканях организма)

Моноциты (в крови)

 

(НК-клетки)

 

Некоторые цитокины и факторы роста

 

 

 

 

 

Название

 

Тип клетки,

 

Функция

 

 

 

 

где образуется

 

 

 

 

 

цитокин

 

 

 

Активация лимфоцитов Интерлейкин-2

 

ТН1, (ЦТЛ)

 

Пролиферация Т-клеток

 

 

γ-Интерферон

 

ТН1, ЦТЛ

 

Активация макрофагов

 

 

Интерлейкин-4

 

ТН2

 

Фактор роста В-клеток

 

 

Интерлейкин-3

 

ТН1, ТН2, (ЦТЛ)

Пролиферация гематопоэтических клеток

Местное воспаление

Интерлейкин-9

 

Т-клетки

 

Активация тучных клеток

 

 

α-Интерферон

 

Лейкоциты,

 

Индукция синтеза антигенов MHC класса I

 

 

 

фибробласты

 

 

 

 

ФНО-α

 

Макрофаги,

 

Развитие местного воспаления

 

 

 

клетки-киллеры

 

 

Системные эффекты

Интерлейкины 1α, 1β

Различные типы

Повышение температуры, пролиферация

и специфические

 

 

клеток

 

гематопоэтических клеток

 

воздействия

 

 

 

 

 

 

на костный мозг

 

 

 

 

 

 

 

Интерлейкин-6

 

ТН2, макрофаги

Индукция синтеза белков острой фазы

 

Эритропоэтин

 

Почки

 

Активация роста эритробластов

 

Колониестимулирующий ТН1, (ТН2), (ЦТЛ)

Активация пролиферации

 

 

фактор гранулоцитов

 

 

предшественников гранулоцитов,

 

и макрофагов

 

 

 

макрофагов и дендритных клеток

Терапевтическое применение цитокинов и факторов роста

Инфекции

Злокачественные опухоли

Шоковые состояния

Аутоиммунные заболевания

Заболевания иммунной системы

Аллергические реакции

Нарушения клеточного роста

Отторжение трансплантата

135