Эксперимент в генетической инженерии

Методы генетической инженерии

230

Методы выделения ДНК

ВВЕДЕНИЕ. Первым этапом большинства генно-инже- нерных экспериментов является выделение, очистка

ихарактеристика ДНК. Особенно важная роль в анализе и картировании ДНК принадлежит ферментам – эндонуклеазам рестрикции.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК. ДНК в разных организмах и клетках может находиться в различных формах, поэтому существует несколько методов ее выделения. Так, у прокариот молекула ДНК не заключена в ядерную оболочку. Сначала бактериальные клетки обрабатывают ферментом, разрушающим клеточную стенку, затем клеточные белки экстрагируют смесью фенола

ихлороформа, а ДНК из растворимой фракции осаждают охлажденным этанолом. Наряду с геномной ДНК в клетке бактерий часто содержатся небольшие по размерам молекулы ДНК – плазмиды. Эта ДНК особенно важна для генно-инженерных экспериментов. Выделение плазмидной ДНК проходит по следующей схеме. После разрушения клеток лизат обрабатывают щелочью, в результате чего белки денатурируют, а геномная ДНК переходит в линейную форму и разбивается на фрагменты. При этом плазмидная ДНК остается замкнутой в кольцо. После центрифугирования денатурированные белки и ДНК осаждаются, а плазмидная ДНК остается в растворе, из которого ее можно осадить спиртом. Для получения более чистых препаратов плазмидной ДНК используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия или очищают ДНК с помощью ионообменной хроматографии на анионите. При выделении небольшого количества ДНК (около 20 мкг) метод называется «минипрепаративным», если же получают несколько миллиграммов ДНК, говорят о «препаративном выделении». ДНК фагов выделяют из зараженной бактериальной культуры. Бактерии отделяют центрифугированием, а фаговые частицы из супернатанта осаждают полиэтиленгликолем. Затем белковые оболочки фагов удаляют фенольной экстракцией, а фаговую ДНК осаждают из раствора спиртом. ДНК эукариот распределена между хромосомами в клеточном ядре. Чтобы выделить клеточную ДНК из животных клеток, их лизируют с помощью додецилсульфата натрия (ДСН, или англ. SDS), а затем обрабатывают РНКазой и протеиназой К, которые разрушают РНК и белки. Белки и SDS удаляют высаливанием, а ДНК из раствора осаждают спиртом. Обычно в качестве источника кДНК многоклеточных организмов служит сплайсированная мРНК. Ее получают из органов или клеточных культур, в которых находятся исследуемые гены. Для выделения мРНК сначала лизируют ядерную оболочку – от ее фрагментов освобождаются центрифугированием. Супернатант обрабатывают фенолом, чтобы удалить белки, а оставшуюся в растворе ДНК осаждают

спиртом. Митохондрии и пластиды фотосинтезирующих организмов обладают собственной ДНК, репликация которой происходит независимо от хромосомной ДНК. Чтобы получить ДНК митохондрий или пластид, органеллы выделяют методом дифференциального клеточного центрифугирования, затем их разрушают, а ДНК осаждают спиртом.

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗЫ) нужны бактериальным клеткам для защиты от чужеродной ДНК. В генной инженерии рестриктазы используют для расщепления длинных цепей ДНК на более короткие фрагменты. Фермент узнает специфическую последовательность ДНК (4–10 нуклеотидов) и расщепляет двойную цепь ДНК с 5'- или 3'-конца от сайта узнавания. При этом одни рестриктазы вносят разрывы несимметрично, так что на концах полученных фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки – так называемые «липкие» концы. Другие рестриктазы расщепляют цепи ДНК симметрично, и на концах фрагментов образуются «тупые» концы. Стратегической основой любого клонирования или эксперимента по экспрессии чужеродной ДНК является рестриктная карта ДНК. Ее получают, сопоставляя и анализируя размеры фрагментов, полученных при расщеплении исследуемой ДНК различными рестриктазами, или после секвенирования ДНК. Можно рассчитать частоту встречаемости сайта рестрикции в молекуле ДНК. Так, сайт AGCT из 4 нуклеотидов – сайт узнавания рестриктазы Alu I – теоретически должен встречаться через каждые 256 (= 44) пар нуклеотидов. Однако в природе последовательность ДНК не является статистически однородной, поэтому истинное количество сайтов рестрикции отличается от расчетного. Частота встречаемости определенной последовательности нуклеотидов также зависит от GC-состава ДНК и, следовательно, может служить специфической характеристикой организма.

Комплекс ДНК и эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеаза

Eco RI в комплексе с ДНК; разрешение 0,2 нм.

Частота встречаемости сайтов узнавания рестриктазами

Сайты узнавания трех приведенных здесь рестриктаз содержат шесть нуклеотидов. В геноме фага λ, имеющем размер 49 000 п.н., должно быть 12 сайтов узнавания для этих рестриктаз. Однако в действительности сайты рестрикции встречаются в геноме значительно реже, что свидельствует о том, что последовательность нуклеотидов ДНК не является статистически однородной.

231