Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия..pdf
Скачиваний:
6
Добавлен:
30.05.2021
Размер:
9.07 Mб
Скачать

Ферменты

102

Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности

ВВЕДЕНИЕ. Ремесло выделки шкур животных было развито еще в античные времена. В этом процессе традиционно используется известь, концентрированные растворы щелочей, серосодержащие соединения, а по классическим (традиционным) методикам, экскременты домашних животных в качестве «ферментсодержащего» компонента. Отсюда сложившееся мнение о выделке кожи как о «грязном» производстве. В 1904 г. Отто Рём впервые подробно изучил процесс получения кожи из шкур животных, описал биохимические реакции каждой стадии и показал важность использования ферментов в этом производстве. Объем протеаз, потребляемых современными кожевенными предприятиями, составляет около 100 т в год.

КОЖА млекопитающих имеет следующий состав: 60–65% воды, 30% белков и 2–10% жиров. Белки кожи в основном (на 90%) представлены коллагеном,

адругие компоненты (кератин, эластин и др.) составляют всего 10%. Эпидермисом называется внешний слой кожи, это 1% толщины всего кожного покрова.

Вэпидермисе выделяют следующие зоны (начиная от внешней поверхности): роговая, блестящая, зернистая и ростковая (или мальпигиева). Расположенный под эпидермисом слой соединительной ткани называется дермисом (другие названия: кориум, кутис) – 85% толщины кожи. В дермисе располагаются корни волос, кровеносные сосуды, потовые и сальные железы. Поверхностная зона дермиса (сосочковая), богатая коллагеновыми волокнами и сосудами, имеет рыхлую структуру и выполняет питательную функцию, а ниже располагается ретикулярный слой из плотной соединительной ткани. Еще глубже находится подкожная клетчатка (15%), состоящая из соединительной ткани и жировых отложений («лицевой спилок»). При выделке кожа освобождается от волос, мышечных компонентов, нефибриллярных белков и воды. Нестабилизированная (плохо выделанная) кожа во влажных условиях быстро разлагается под действием бактерий,

апри высыхании становится ломкой.

ОБРАБОТКА КОЖИ ФЕРМЕНТАМИ. Свежие шкуры консервируют (солевание), чтобы предотвратить гниение в результате заражения микроорганизмами. После этого сухие шкуры можно хранить в течение продолжительного времени. Затем следует стадия отмоки, когда шкуру помещают в раствор, содержащий повех- ностно-активные и другие вещества для удаления грязи, крови, остатков жиров и нефибриллярных белков. Для ускорения и улучшения качества отмоки в современном кожевенном производстве часто используют протеолитические ферменты. Сырье, предназначенное для изготовления дорогих сортов кожи, сохраняющих естественный рисунок, проходит обработку протеиназами, при которой происходит полное разрушение

пигментных включений, потовых и сальных желез. Такие сорта изготавливают с применением прозрачных анилиновых красителей и поэтому их называют анилиновыми. Применяемые ферменты должны проявлять высокую активность, однако при этом не разрушать коллаген. Наибольшее распространение получили трипсин (панкреатический экстракт) и другие протеиназы, выделенные из Bacillus subtilis и Aspergillus sojae. Следующая стадия – золение – заключается в обработке шкуры суспензией извести с добавлением сульфита натрия, в результате ослабляется связь между шерстью и дермисом. Раньше такую обработку осуществляли вручную втиранием суспензии в поверхность шкуры. В современной промышленности золение проводят с использованием сильнощелочных растворов гидроксида кальция, сульфита натрия, а также устойчивых в щелочных условиях протеиназ, например из Bacillus alkalophilus. Затем следует стадия мягчения, во время которой происходит обеззоливание с помощью солей аммония или органических кислот. Особая роль в мягчении принадлежит панкреатическим ферментам и нейтральным и щелочным протеазам, выделенным из бактерий и грибов. Эти ферменты удаляют остатки неколлагеновых белков и разрыхляют коллаген, делая его более доступным для окрашивания. Для хромового дубления также используют протеазы, выделенные из грибов. Попытки усовершенствовать технологический процесс и повысить эффективность процессов отмоки, золения и мягчения, объединив их в одном производственном этапе пока не увенчались успехом, однако в этом направлении ведутся активные работы. Уже предложены технологии, позволяющие на 50% снизить время обработки и количество используемой воды.

ШЛИХТОВАНИЕ ТЕКСТИЛЬНЫХ ИЗДЕЛИЙ. В ткацком производстве качество продукции и производительность в значительной мере зависят от прочности нити. Для того чтобы не допустить разрыва волокон при многократном растяжении, нити шлихтуют, то есть наносят на них тонкий слой клеящего вещества. Чаще всего в качестве шлихты используют крахмал. Перед окрашиванием и дальнейшей обработкой полученной ткани необходимо удалить шлихту. В случае крахмальной шлихты для этого используют α-амила- зу, выделяемую обычно из Bacillus sp. α-Амилаза и целлюлаза используются также при производстве джинсовых («stone-wash») тканей (как правило, эти ткани приобретают особый внешний вид при стирке в присутствии камней и песка).

Строение кожи млекопитающих и выделка кожи

 

Хранение

Отмока, золение

Волос

 

 

 

Солевание

 

 

Эпидермис

(консервирование)

сырой кожи

(освобождение

 

 

Кровенос-

 

 

 

 

 

 

от шерсти,

 

 

 

 

 

 

разрыхление)

ный сосуд

 

Дермис

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Потовая

 

(кориум)

 

 

 

 

железа

 

 

 

 

 

 

 

Жир

 

Подкожная

 

 

 

 

 

 

клетчатка

 

 

 

 

Мездрение

 

Горизонтальное

 

Двоение

Обеззоливание,

(на этой стадии кожа

разделение кожи

 

 

мягчение, пикелевание,

называется «гольем»)

при пропускании

 

 

хромовое дубление

 

 

через специальные станки

 

 

 

 

 

Внешняя поверхность

 

 

 

 

 

 

 

Дермис

 

 

 

 

 

Мездра

 

 

 

 

 

Отжим

Фальцевальный нож

 

Нейтрализация,

Подсушивание

 

 

 

 

 

дубление, окрашивание,

 

Нарезание

 

Этот полуфабрикат

жирование

 

 

 

кожи называется

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

вет-блю

 

 

 

Вытягивание

Высушивание

Кондицио-

Правление кожи

 

 

 

 

нирование

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кожа на этой стадии

 

 

 

 

 

 

 

называется крастом

Ферменты в кожевенном производстве

 

 

 

Этап отделки

 

рН

Объект воздействия

Фермент

 

Отмока (разрушение белков,

7–9

Нефибриллярные белки, Протеиназы из грибов и бактерий,

клеточных включений,

 

 

жиры

 

трипсин (панкреатический экстракт)

освобождение от шерсти)

 

 

 

 

 

Обезволашивание

 

10

Кератин

 

Кератиназы, протеиназы

Золение

 

 

12,5

Неколлагеновые белки

Протеиназы из грибов и бактерий

 

 

 

 

 

 

(эластаза)

 

Обеззоливание и мягчение

8–9

Остатки белков,

 

Протеиназы из грибов и бактерий,

 

 

 

 

жировые клетки

 

трипсин (панкреатический экстракт)

Пикелевание, кислое мягчение

5–6

Коллаген

 

Протеиназы из грибов и бактерий,

(увеличение эластичности,

 

 

 

трипсин (панкреатический экстракт)

улучшение впитывания

 

 

 

 

 

 

красителя)

 

 

 

 

 

 

 

Разрыхление полуфабриката

6

Кожа после хромового

Протеиназы из грибов

вет-блю

 

 

 

 

 

дубления

 

Шлихтование в текстильной промышленности

 

 

 

Замачивание

Водяной пар

Разрушение

 

Отмывка

 

и пропитывание

 

 

крахмала

 

 

 

крахмальным

 

Обычная или термостабильная α-амилаза из Bacillus (60–110 °С)

раствором

 

 

 

 

 

 

 

 

103

Ферменты

Перспективы получения ферментов для промышленных технологий

ВВЕДЕНИЕ. Стремительный прогресс генетической

тов для промышленного применения. Наиболее

инженерии обусловил развитие новых подходов к по-

наглядны успехи направленной эволюции для получе-

иску ферментов: усовершенствованы традиционные

ния ферментов, обладающих высокой стабильностью

методы скрининга, разработаны методики переноса

в экстремальных температурных и кислотно-щелоч-

генетической информации между различными орга-

ных условиях. Методами биоинформатики можно

низмами и во многих случаях найдены пути увеличе-

проводить ускоренный поиск новых ферментов на ос-

ния выхода необходимого фермента. Несмотря на

нове данных, полученных при секвенировании гено-

это, в промышленном синтезе ферменты все же ред-

мов. К настоящему времени полностью секвенирова-

ко выдерживает конкуренцию с химическим синте-

ны геномы нескольких сотен микроорганизмов: при

зом. Во-первых, для многих важнейших реакций син-

сравнении их последовательностей с консенсусными

теза, например, реакции образования углеродных

последовательностями известных ферментов уда-

связей, известно лишь несколько ферментов, не тре-

лось обнаружить несколько сотен ферментов с неяс-

бующих дорогостоящих кофакторов. Во-вторых, вре-

ной субстратной специфичностью. С помощью ПЦР

мя, которое затрачивается на разработку метода по-

были получены кДНК этих ферментов, однако поиск

лучения фермента и на повышение выхода продукта

природных субстратов – чрезвычайно сложная зада-

в штаммах-продуцентах, значительно превышает

ча. Анализ консенсусных областей 16S-рРНК раз-

время на полный цикл внедрения метода химическо-

личных бактерий позволил предположить, что к на-

го синтеза веществ для фармакологии или сельского

стоящему времени лишь 1% всех существующих

хозяйства. Ввиду явного отставания ферментативно-

бактерий классифицированы и могут быть культиви-

го синтеза от химического становится очевидной ак-

рованы. В связи с этим осуществляются попытки об-

туальность следующих направлений развития науки:

наружения новых ферментов из некультивируемых

1) рациональная белковая инженерия; 2) направлен-

микроорганизмов путем выделения и экспрессии

ная эволюция; 3) новые методы скрининга для изуче-

ДНК («Метагеном») из естественных природных ис-

ния огромного разнообразия природных ферментов.

точников. Для этого выделяют ДНК, при помощи

НОВЫЕ ИСТОЧНИКИ ФЕРМЕНТОВ. Живые организмы

ферментов расщепляют ее на фрагменты небольшо-

обитают в самых разнообразных условиях и выраба-

го размера, чтобы их можно было встроить в вектор,

тывают ферменты, приспособленные для функциони-

затем экспрессируют их в клетках-хозяевах и прово-

рования в специфических средах. Механизмы при-

дят функциональный анализ полученных продуктов.

способления к условиям существования особенно

Несмотря на то что методика еще не окончательно

разнообразны у микроорганизмов: в процессе эволю-

разработана, таким способом уже удалось выделить

ции некоторые из них сумели приспособиться к са-

и охарактеризовать несколько ферментов с необыч-

мым экстремальным условиям – рН, температура,

ными функциями.

жесткий осмос и др. При систематическом скрининге

 

необычных сред обитания (щелочные или кислые

 

природные среды, глубоководные впадины, горячие

 

источники и др.) регулярно обнаруживают новые ми-

 

кроорганизмы, из которых выделяют ферменты с не-

 

обычными свойствами. Так, ДНК-полимераза I (Taq-

 

полимераза), широко применяемая для проведения

 

ПЦР, выделена из термофильной бактерии Thermus

 

aquaticus, обитающей в гейзере (90 °С) на террито-

 

рии Йеллоустонского заповедника. В гидротермаль-

 

ных источниках (110 °С, 150 бар) Средиземного мо-

 

ря на глубине 1500 м были обнаружены не

 

изученные ранее микроорганизмы, относящиеся к

 

группе архей. Оказалось, что ДНК-полимераза этих

 

организмов делает меньше ошибок, чем Taq-полиме-

 

раза в аналогичных условиях. Некоторые из этих

 

ферментов уже поступили в продажу, в частности

 

Pfu- и Tma-полимеразы.

 

НОВЫЕ МЕТОДЫ СКРИНИНГА. Современные методы молекулярной биологии, в частности белковая инженерия или направленная эволюция, открывают новые

104 возможности для скрининга и оптимизации фермен-

Разнообразие живых организмов (число видов)

Простейшие 30 800

Высшие растения 248 400

Водоросли 26 900 Грибы 69 000

Прокариоты (бактерии и археи) 4 800 Вирусы 1 000

Животные 281 000

 

 

 

 

 

 

Насекомые 751 000

 

 

 

 

 

 

 

Свойства различных ДНК-полимераз

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Источник

Время

3' 5'-экзонуклеаз-

5' 3'-экзонуклеаз-

Свойства концевых

 

 

 

полужизни

ная активность

ная активность

участков продукта

 

 

 

фермента

 

 

 

 

 

 

 

при 95° С, мин

 

 

 

 

 

 

Thermus aquaticus

40

Отсутствует

Присутствует

3'А

 

 

Thermotoga maritima

20

Отсутствует

Присутствует

3'А

 

 

Pyrococcus furiosus

> 120

Присутствует

Отсутствует

?

 

 

Thermococcus litoralis

1380

Присутствует

Отсутствует

> 95% тупых концов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pазнообразие липаз (структура и консенсусная последовательность)

Candida antarctica B (S = серин

в активном центре)

– TWSQG –

0,5 нм

 

 

 

Rhizomucor miehei

– GHSLG –

Candida rugosa

– GESAG –

 

 

 

 

 

Способы получения новых ферментов

 

 

 

 

Скрининг ферментов

Белковая

Направленная

Выделение ДНК из проб, отобранных

 

 

инженерия

эволюция

в необычных средаx обитания

 

Клонирование

Метод получения

 

Экспрессия в организмах-хозяевах

 

(не всегда)

 

 

 

 

 

 

 

Скрининг in silico (базы

Применение

 

Традиционный путь

 

 

данных о структуре ДНК)

в промышленных технологиях

 

 

 

ДНК

Расщепление

Экспрессия в клетках-хозяевах

Отбор

 

Из донных

рестриктазами

E. coli, стрептомицеты и др.

Выбор

 

Получение фрагментов

 

отложений,

 

 

«подходящего»

 

из почвы

ДНК необходимой длины

 

 

фермента

105

 

 

 

 

 

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.