микробиологии

Усовершенствование штаммов микроорганизмов

ВВЕДЕНИЕ. Микроорганизмы, выделенные из при-

антибиотика и с антибиотиком (например, с пеницил-

родной среды обитания, редко полностью отвечают

лином). Основными преимуществами такого метода

требованиям биотехнологического производства. По-

является возможность проводить одновременный

этому необходимым подготовительным этапом явля-

анализ большого количества полученных мутантов

Основы

ется многократное повторение мутагенеза и последу-

(несколько сотен на одной чашке). В результате дей-

ющего отбора мутантов, обладающих искомыми

ствия сильных мутагенных факторов часто происхо-

свойствами. Наиболее часто задачей таких экспери-

дят изменения в нескольких генах, поэтому необхо-

ментов является получение штаммов, продуцирую-

димо проверить не только способность мутантов

щих больше целевого вещества и меньше побочных

образовывать необходимый продукт, но и сохран-

продуктов или обладающих лучшими технологиче-

ность свойств, характерных для дикого штамма. Для

скими характеристиками (сокращение времени фер-

этого отобранные клетки выращивают в качалочных

ментации, отсутствие нежелательной пигментации,

колбах в условиях, максимально приближенных к та-

устойчивость к бактериофагам и др.). Одним из пре-

ковым в производственном процессе, и отбирают

имуществ микроорганизмов является их короткий

клетки, обладающие улучшенными свойствами. Пов-

жизненный цикл (часто менее 1 ч). Это позволяет

торение нескольких раундов мутагенеза с последую-

достаточно быстро получать и анализировать боль-

щим отбором позволяет отобрать штаммы, которые

шое количество мутантов. При работе с эукариотиче-

наилучшим образом удовлетворяют всем требовани-

скими микроорганизмами (например, грибами)

ям технологического процесса. Для устранения не-

необходимо принимать во внимание процесс реком-

нужных приобретенных свойств полученные штаммы

бинации. Знание обмена веществ, его регуляции и

скрещивают с дикими штаммами.

структуры ДНК, кодирующей ферменты, позволяет

СЕЛЕКЦИЯ В НЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРЕ. Отбор мутан-

модифицировать геном микроорганизмов, целена-

тов можно проводить в непрерывной культуре в фер-

правленно «выключая» или «активируя» те или иные

ментере: для этого клетки микроорганизмов выращи-

стадии обмена веществ (metabolic engineering).

вают в среде с мутагеном и осуществляют при этом

МУТАГЕНЕЗ. Вероятность спонтанной мутации в нор-

селективное воздействие, например постепенно за-

мальном гене (под действием естественных мутаге-

меняют один источник углерода на другой. В таких

нов или при репликации) составляет 10–6–10–7. Как

условиях выживают лишь те микроорганизмы, кото-

правило, такие мутации остаются «молчащими» из-за

рые в результате мутагенеза приобрели способность

генетической или функциональной супрессии или ста-

утилизировать новый источник углерода. Описанный

новятся мишенью системы репарации ДНК. Для усо-

способ, однако, не позволяет проводить отбор мутан-

вершенствования штаммов осуществляют более эф-

тов с повышенным выходом продукта.

фективный искусственный мутагенез: например, при

ультрафиолетовом облучении или при введении мута-

генных веществ. Путем изменения длительности му-

тагенного воздействия и путем подбора мутагенных

веществ удается варьировать частоту мутаций в клет-

ках. В результате действия мутагенных факторов, как

правило, 90–99% клеток погибают, а затем из остав-

шихся клеток отбирают мутантов, которые обладают

желаемыми фенотипическими признаками.

ОТБОР МУТАНТОВ В ПОВЕРХНОСТНЫХ КУЛЬТУРАХ.

Основным фенотипическим признаком, рассматри-

ваемым при усовершенствовании штаммов микроор-

ганизмов, является их способность образовывать

большое количество продукта. Для отбора мутантов,

удовлетворяющих этому требованию, разрабатывают

систему отбора. В качестве признака для отбора мо-

жет служить устойчивость к антибиотику, ядовитым

веществам или фаговой инфекции. Полученные пос-

ле проведения мутагенеза клетки высевают в чашки

Петри на твердые селективные среды, где вырастают

лишь те колонии, которые обладают необходимой ус-

200

тойчивостью. Для отбора ауксотрофных мутантов ре-

плики колоний помещают на питательную среду без

Ионизирующее (рентге-

Образование одноили двухцепочечных

Устойчивые генетические изменения

новское) облучение

разрывов в ДНК

Ультрафиолетовое

Нитрит

При дезаминировании аденина образуется

Точечные мутации

гипоксантин, а цитозина – урацил

Алкилирующие агенты

Алкилированные пурины

Точечные мутации

Аналоги оснований

Включаются в ДНК при репликации

Устойчивые генетические изменения

Акридиновый оранжевый

Интеркалирует в ДНК

Устойчивые генетические изменения

Транспозоны

Переносят участки ДНК внутри хромосомы

Маркирование генов

Метод реплик и пенициллиновый метод

Пенициллиновый метод

Получение реплики

Клеточная суспензия бактерий, чувствительных

Штемпель со

к действию ампициллина

стерильной

Мутагенез

бархоткой

Смесь мутантных и диких клеток

Выращивание в полной

питательной среде

Мутанты и клетки дикого типа

Выращивание

на минимальной среде

Полная

Полная

с ампициллином

питательная среда

питательная

Клетки дикого типа погибают под действием ампициллина

с антибиотиком

среда

Ампициллин удаляют из

Инкубация

среды, выращивание на

в термостате

полной питательной среде

Вырастают только мутанты

Получение реплик

и посев на минимальную

Штаммы, устойчивые

Контрольная чашка

и полную среды

Ауксотрофные мутанты вырастают только

к антибиотику

с полной питательной

средой

на полной питательной среде

Селективные питательные среды

Выращивание при

Минимальная

Питательная среда

Питательная среда

неоптимальной

питательная среда

с индикатором на метаболит

с антиметаболитом

температуре

с метаболитами

«Температурные»

мутанты

дефект в биосинтезе

дефект фермента, разлагаю-

измененная скорость синтеза

некоторого компонента*

щего определенный субстрат

фермента или продукта

Питательная среда, тес-

Питательная среда и тес-

Питательная среда и казеин

Питательная среда

товые штаммы патоген-

товые штаммы патоген-

и трибутирин

ных микроорганизмов

ных микроорганизмов

и β-лак-

тамаза

«Лактамазная» устой-

Повышенный выход

Повышенный выход

Повышенный выход липаз

чивость: устойчивые

антибиотика

протеиназ

к лактамазе продуцен-

ты антибиотиков

201