Трансгенные растения: методы получения

ВВЕДЕНИЕ. Разработано несколько способов введения чужеродной ДНК в геном растений. Прежде всего, для трансформации двудольных растений, таких как томаты, табак, картофель, горох, фасоль, используют Ti-плазмиду Agrobacterium tumefaciens. Для одно- и двудольных растений, которые могут быть регенерированы из протопластов, применяют также методы электропорации или трансформации протопластов. Целые растения можно трансформировать при помощи микроинъекций или биолистики. Для доказательства успешности прохождения трансформации используют репортерные гены или методы ПЦР.

Ti-ПЛАЗМИДЫ. Почвенная бактерия A. tumefaciens может инфицировать двудольные растения и вызывать образование корончатого галла – опухолевого разрастания клеток на корнях растений. При этом в растение проникает Ti-плазмида (от англ. tumor inducing) размером примерно 200 п. н., а ее фрагмент порядка 15–30 п. н., так называемая T-ДНК, интегрирует в хромосомную ДНК растения. Для трансформации двудольных используют модифицированные Ti-плазмиды, которые остаются инфекционными, но не несут генов вирулентности. Помимо гена, который необходимо клонировать, они несут T-ДНК, точки начала репликации для Escherichia coli или для какоголибо другого организма-хозяина, с которым легко работать в лабораторных условиях, и репортерного гена. Для трансформации клеток культуры тканей их заражают рекомбинантным штаммом A. tumefaciens. Используя орган-специфические промоторы и лидерные последовательности, можно не только встроить Т-ДНК в определенное место, обеспечив экспрессию в листьях, корнях, многочисленных внутриклеточных компартментах (например, в хлоропластах или митохондриях), но и сделать экспрессию зависимой от внешних условий, таких как высокая температура, засуха, поражение патогеном, уровень освещенности или режим день/ночь. Для трансформации используют также Ri-плазмиды A. rhizogenes (возбудитель «кудрявости корней»). Растительные вирусы, например каулимовирусы или геминивирусы, не используются в качестве векторов, так как в них можно встраивать лишь небольшие фрагменты чужеродной ДНК, как правило, они инфицируют немногие виды растений, и схема их репликации чрезвычайно сложна.

трансформированы и другие однодольные. С помощью Ti-плазмид можно трансформировать протопласты однодольных. Возможно также применение других методов, основанных на работе с протопластами: микроинъекции, электропорация и обусловленное липосомами слияние, однако дальнейшая регенерация протопластов в нормальные растения чрезвычайно затруднена. В этом случае для трансформации растительных клеток используют метод биолистики. При этом зародыши растений бомбардируют золотыми или вольфрамовыми микрочастицами, на которых нанесена чужеродная ДНК.

ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА. Для этой очень важной практической цели используют два метода. Как в случае трансгенных животных, при гомологичной рекомбинации можно подавить экспрессию путем встраивания в ген чужеродной нуклеотидной последовательности (нокаутные растения). Однако эффективность этого метода при работе с растениями, в отличие от животных, очень мала. Большое распространение получил метод клонирования генамишени в антисмысловой ориентации под контролем соответствующего промотора. В трансформированном растении помимо нормальной смысловой мРНК с клонированного гена синтезируется антисмысловая РНК, которая образует комплекс с мРНК, и этот комплекс разрушается РНКазами как нефункциональный. В данном случае речь идет о статистическом процессе, происходящем с вероятностью 1–2%.

ГЕНОМ РАСТЕНИЙ. К настоящему времени полностью секвенированы геномы нескольких растений (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa – рис). Активно исследуются геномы кукурузы, табака, хлопка, пшеницы, ячменя, картофеля и других полезных растений.

ВВЕДЕНИЕ. В США с 2004 г. разрешено культивировать более 30 трансгенных сельскохозяйственных растений; они занимают площадь более 50 млн га. К ним относятся хлопок, картофель, кукуруза, рапс, соя и томаты. Чаще всего сельскохозяйственные трансгенные растения содержат клонированные гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, инсектицидам или вирусам. Не так давно появились трансгенные растения с повышенной засухоустойчивостью и с измененной окраской цветков.

РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ. Примерно 10% мирового урожая теряется из-за наличия сорняков. Идеальный гербицид должен действовать в незначительных концентрациях, не оказывать отрицательного влияния на рост культурного растения, быстро разлагаться и не попадать в грунтовые воды. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам, либо содержат в большом количестве гербицид-чувст- вительный белок, благодаря чему гербицид связывается хуже или совсем не взаимодействует со своей мишенью, либо инактивируют гербицид, разлагая его. Например, соевые бобы, устойчивые к глифосату (Roundup™), были получены в результате выделения гена 5-О-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синта- зы (EPSP-синтаза является мишенью гербицида) из устойчивых к глифосату штаммов Escherichia coli и его последующего клонирования под контролем растительного промотора. Устойчивость к фосфинотрицину (BastaТМ) – ингибитору глутаминсинтазы – является следствием клонирования гена фосфинотрицинацетилтрансферазы (РАТ) из Streptomyces hygroscopicus в табаке, картофеле, рапсе и других растениях.

РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ДЕЙСТВИЮ НАСЕКОМЫХ.

Bacillus thuringiensis синтезирует белок с молекулярной массой 250 кДа (δ-эндотоксин, ВТ-токсин), который превращается в высокоактивный токсин в результате протеолиза в кишечнике насекомого. В растениях или в кишечнике млекопитающих такого превращения не происходит, поэтому ВТ-токсин используют в качестве яда для насекомых во множестве видов сельскохозяйственных растений. За счет оптимизации кодонов и использования более сильного конститутивного промотора, например 35S-промо- тора вируса мозаики цветной капусты, можно увеличить уровень экспрессии белка примерно в 100 раз. Другой пример ядов против насекомых – специфические ингибиторы протеаз.

РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГРИБКОВЫМ ИНФЕКЦИЯМ. Заражение грибами приводит к значительным потерям урожая. В качестве интересного исторического примера можно привести картофельную гниль (Phytophthora infestans), которая в XIX в. стала причиной голода в Европе, в частности в Ирландии.

С помощью экспрессии хитиназы или глюканазы, способных разрушать клеточную стенку грибов, удалось получить растение табака, устойчивое к грибковой инфекции. Экспрессия белка, инактивирующего рибосомы грибов (RIP), также обеспечивает устойчивость растения к грибам.

РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ДЕЙСТВИЮ ВИРУСОВ.

Картофельный вирус 4 и вирус сахарной свеклы rhizomania наносят большой вред сельскому хозяйству. Поэтому осуществляются попытки вмешаться в механизм репликации вируса путем экспрессии нефункциональных вирусных белков (перекрестная защита), а также экспрессировать антитела к вирусам или рибозимам типа «головки молотка».

РАСТЕНИЯ С ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К СТРЕССУ. Многие разновидности физиологического стресса (яркий свет, ультрафиолетовое излучение, жара или засуха) вызывают образование кислородных радикалов, прежде всего анион-радикалов кислорода. Трансгенные растения, несущие ген фермента супероксиддисмутазы под контролем 35S-про- мотора вируса мозаики цветной капусты, становятся не только устойчивыми к физиологическим стрессам, но и медленнее увядают.

ИЗМЕНЕНИЕ ОКРАСКИ ЦВЕТКОВ, СТАРЕНИЕ. Для декоративных растений важны цвет и форма, для плодовых – возможность длительного хранения и аромат. На эти свойства можно влиять путем встраивания чужеродного гена или выключения существующего. Для получения измененного пигмента, чаще всего флавоноид- и антоциангликозида, и для расширения генетического потенциала используют гены, обеспечивающие синтез вторичных метаболитов из других растений. В качестве примера можно привести «синюю розу», в которой экспрессируется Р450-монооксигеназа и образуется синий пигмент. Для выключения генов используют антисмысловые РНК: этот подход был успешно применен при создании томатов «Флавр–Савр».